納洛酮對果糖偏好大鼠自主活動和自主運動行為影響的研究*

杜 潔，王海英, 焦廣發(fā)，2

(1.河北體育學(xué)院 運動人體科學(xué)系，河北 石家莊 050041；2.河北醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊，050041)

隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，存在異?；虿B(tài)攝食行為的人群數(shù)量越來越多，而運動量的大幅減少以及過度運動行為(運動成癮)人群增多的現(xiàn)象也日益顯現(xiàn)，這使成癮行為問題成為世界范圍內(nèi)研究的熱點問題。美味食物可以激活中腦內(nèi)的獎賞機(jī)制，使攝食量和攝食次數(shù)增多[1]。當(dāng)這種過度攝食行為轉(zhuǎn)為強(qiáng)迫狀態(tài)或失去控制時即稱為食物成癮[2]。腦內(nèi)獎賞系統(tǒng)失調(diào)可能是攝食異常導(dǎo)致肥胖的機(jī)制[3]。根據(jù)精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM)的分類[4]，食物成癮主要指的是BED和神經(jīng)性貪食(bulimia nervosa，BN)兩種類型的攝食行為異常。近年來的研究中建立了以糖、脂高熱量食物為誘導(dǎo)物的食物成癮動物模型[5]。成癮狀態(tài)伴有多種行為異常，但對于食物成癮攝食活動與運動行為之間的關(guān)系和機(jī)制尚不清楚。

運動行為主要分為無目的性的自主活動和主動性的運動。自主活動(locomotor activity)是機(jī)體除基礎(chǔ)代謝、食物產(chǎn)熱作用外的另一種主要能量支出形式，但是關(guān)于自主活動的調(diào)控機(jī)制和其他生理作用研究報道較少[6]，而也有學(xué)者認(rèn)為自主活動是一種與攝食行為相關(guān)聯(lián)的重要補(bǔ)償機(jī)制[7]。主動運動(voluntary exercise)是決定長期健康的重要因素，但營養(yǎng)因素可以改變主動運動行為的易感性[8]。大鼠進(jìn)行主動轉(zhuǎn)輪運動的行為不僅代表身體活動的水平，也是一種環(huán)境與基因相互作用的復(fù)雜行為，代表神經(jīng)系統(tǒng)存在獨立的改變能量平衡活動的機(jī)制[9]。

攝食與運動是機(jī)體維持能量平衡的基本生理活動，但生理學(xué)和心理學(xué)學(xué)家都認(rèn)識到攝食行為異常與運動行為的改變存在某種聯(lián)系的共病現(xiàn)象(comorbidity)[10]，而對這二者之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制并不清楚。阿片肽是成癮獎賞機(jī)制發(fā)揮作用的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，主要由阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin，POMC)產(chǎn)生。阿片肽受體在中樞內(nèi)的廣泛分布顯示出這一物質(zhì)參與正常和異常攝食行為[11]。阿片肽受體激動劑DAMGO能促進(jìn)大鼠產(chǎn)生對糖的喜好[12]。納洛酮(Naloxone, Nal)是阿片肽u受體阻斷劑，具有治療食物成癮的作用[13]。激活或阻斷阿片肽系統(tǒng)均伴有自主活動的改變，而運動成癮現(xiàn)象進(jìn)一步證實阿片肽也參與了自主運動行為調(diào)控的神經(jīng)內(nèi)分泌活動[14]。因此，POMC的阿片肽系統(tǒng)可能在攝食行為和運動行為之間發(fā)揮著重要關(guān)聯(lián)作用。本研究推測Nal可能會對食物成癮狀態(tài)下運動行為產(chǎn)生影響。本研究主要觀察果糖偏好大鼠注射Nal后攝食行為、自主活動和主動運動行為的變化，探討中樞阿片肽系統(tǒng)在果糖成癮大鼠攝食和運動行為的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體重200～250g，鼠齡6～8周，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證編號：HB-201503002。大鼠單籠喂養(yǎng)，室溫22～24℃，濕度50%，12h光照/12h黑暗周期，開燈時間為上午7時。動物實驗方案符合動物倫理學(xué)規(guī)定(National Research Council, 1996)，并得到河北醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，大鼠隨機(jī)分為正常喂養(yǎng)對照組(Control, Con，15只)和果糖偏好模型組(Fructose Preference，F(xiàn)P，15只)。

1.2 果糖偏好模型方案

FP組大鼠下午3-4點限制飲水適應(yīng)3天。每日上午8時禁食后，腹腔注射LiCl(0.15M，1ml/100g 體重)，2h后給予10%果糖溶液30min。下午3-4點限時飲水1h，除誘導(dǎo)期間2.5h外，其他時間自由攝食。連續(xù)誘導(dǎo)7天后再參照Avena，強(qiáng)化方法為大鼠每天不規(guī)律時間給予果糖溶液30min，強(qiáng)化期間自由攝食水[13]。Con組注射生理鹽水，在相應(yīng)的時間段給予水，其他安排與FP組相同。LiCl 購于MP Biomedicals (上海)公司，果糖購于Biotopped公司。

1.3 果糖偏好測試

模型制備結(jié)束后，首先監(jiān)測FP和Con兩組在自由攝食和飲水狀態(tài)下的體重、24h內(nèi)攝食量和飲水量等生理指標(biāo)，測試前3天Con組每天下午給予10%果糖溶液30min，避免大鼠新奇恐懼對測試實驗的影響[15]。

兩瓶法測定FP和Con兩組大鼠果糖溶液偏好，同時給大鼠提供10%果糖溶液和純水各一瓶，測定30min內(nèi)大鼠對果糖溶液和水的攝取量，測試前大鼠禁水12h。24h果糖溶液攝入量測試是測定FP和Con兩組大鼠一個光照/黑暗周期24h的10%果糖溶液攝取量。

1.4 Nal干預(yù)后監(jiān)測

FP組大鼠分別監(jiān)測自由飲水(ad libitum+Water)、腹腔注射生理鹽水自由飲用果糖溶液(Saline+Fructose)、腹腔注射Nal(Sigma, St. Louis; 3mg/kg, i.p.)[13]后自由飲用果糖溶液(Nal+Fructose)三種干預(yù)下的24h代謝活動和主動運動行為。注射時間為早上7：00。三種干預(yù)條件的代謝活動監(jiān)測間隔1d進(jìn)行，間隔期間大鼠自由攝食、飲水，并在上午10時給予果糖溶液30min。在整個實驗期間大鼠均自由攝食普通飼料。

1.4.1 代謝活動監(jiān)測

大鼠攝食、攝水行為和自主活動采用美國Columbus代謝分析系統(tǒng)(CLAMS; Columbus Instruments)進(jìn)行監(jiān)測。上午9-10時將大鼠放入代謝籠中，進(jìn)氣流量2L/min，系統(tǒng)持續(xù)提供飲水和飼料，實時監(jiān)測大鼠自主活動。自主活動是通過大鼠阻斷紅外光線束的次數(shù)表示，指標(biāo)為中斷總次數(shù)和活動的中斷次數(shù)，差值為大鼠重復(fù)動作次數(shù)。系統(tǒng)記錄的重復(fù)動作主要指大鼠的整理活動，這種動作通過監(jiān)測重復(fù)阻斷同一個光束的次數(shù)獲得。

1.4.2 主動運動監(jiān)測

采用自主運行跑輪對大鼠主動運動行為進(jìn)行監(jiān)測，監(jiān)測前于造模最后三天每天下午訓(xùn)練大鼠在跑輪中活動30min。監(jiān)測時大鼠于上午7：00單籠喂養(yǎng)于具有轉(zhuǎn)輪的籠中，記錄24h跑輪轉(zhuǎn)數(shù)，同時監(jiān)測大鼠攝食食量、攝水或攝果糖溶液量。由于主動運動行為個體差異較大，F(xiàn)P組大鼠主動運動變化以其自身在攝水條件下的運動量為參照，計算比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±SME)表示，并用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，F(xiàn)P組與Con兩組各指標(biāo)比較，以及FP組注射Saline和Nal下主動運動量比較采用獨立樣本t檢驗。FP組自由攝食水，以及注射Saline和Nal干預(yù)果糖喂養(yǎng)狀態(tài)下的攝食量和自主活動次數(shù)比較采用one-way ANOVA檢驗，方差分析后采用Tukey檢驗，F(xiàn)P組的飲水量與注射Saline和Nal后果糖攝入量比較因方差不齊采用Wilcoxon秩和檢驗。統(tǒng)計學(xué)差異為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 果糖偏好BED模型檢驗

大鼠誘導(dǎo)果糖BED模型后，F(xiàn)P組與Con兩組大鼠體重(t(28)=-0.446， p=0.659)、攝食量(t(28)=0.695，p=0.493)和攝水量(t(28)=-1.512，p=0.142)無差異指標(biāo)比較無差異(Table1)。利用雙瓶測試對兩組大鼠進(jìn)行果糖偏好測試(Fig.1A、B)，結(jié)果顯示FP組大鼠果糖攝入量高于Con組大鼠(t(28)=19.219，p<0.001)，F(xiàn)P組嗜好比顯著高于Con組(t(28)=15.170，p<0.001)，同時FP組大鼠24h果糖攝入量高于Con組(t(28)=13.326，p<0.001)(Fig.1C)。

Table 1. Body weight, food intake and water intake in FP and Con rats after food addiction model procedure

Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from Con *p<0.05, ** p<0.01.

2.2 Nal對果糖偏好BED大鼠攝食活動的影響

FP組大鼠正常飲水量與注射Saline或Nal后24h果糖溶液的攝入量結(jié)果顯示(Z=-3.408，p=0.001)，注射Saline后果糖攝入量高于飲水量(p<0.001)，注射納洛酮后果糖攝入量下降(P<0.001)，但仍高于飲水量(P<0.001)。FP組大鼠24h普通飼料的攝入量(F(2,42)=34.350， p<0.001)果糖喂養(yǎng)狀態(tài)低于飲水狀態(tài)期間(p<0.05)，但注射納洛酮后果糖喂養(yǎng)狀態(tài)下攝食量下降(p<0.001)(Fig.2)。

Fig.1. Two-bottle test(A、B) and 24h-fructose intake test(C)Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from Con *p<0.05, ** p<0.01.

Fig.2. The 10% fructose intake (A) and chow intake (B) for 24h were decreased by Nal in FP rats

2.3 Nal對果糖偏好BED大鼠自主活動和主動運動的影響

FP組大鼠果糖喂養(yǎng)期間24小時水平方向上自主活動的總次數(shù)(F(2,42)=93.151，p<0.001)、位置移動次數(shù)(F(2,42)=54.966，p<0.001)和重復(fù)動作次數(shù)(F(2,42)=211.723，p<0.001)，以及垂直方向自主活動總次數(shù)(F(2,42)=76.78，p<0.001)均高于飲水狀態(tài)下相應(yīng)指標(biāo)(p<0.001)。注射納洛酮后FP組大鼠水平方向和垂直方向自主活動水平均下降(p<0.001)，并且水平方向上的自主活動低于飲水狀態(tài)(p<0.001)(Fig.3)。

Fig.3.The locomotor activity for 24h was decreased by Nal in FP ratsNal: naloxone. Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from ad libitum water *p<0.05, **p<0.01. Differs from I.P saline #p<0.05, ##p<0.01.

由于FP組大鼠自主活動的個體差異和時相性，F(xiàn)ig.4A，B顯示FP組中一只大鼠在不同狀態(tài)下24h內(nèi)不同時間段內(nèi)的變化趨勢。按白天和夜晚分段統(tǒng)計垂直活動(F(2,42)=76.793，p<0.001; F(2,42)=76.777，p<0.001)和水平活動(F(2,42)=94.635，p<0.001；F(2,42)=90.904，p<0.001)狀態(tài)，F(xiàn)P組大鼠在果糖喂養(yǎng)期間24h內(nèi)水平方向和垂直方向自主活動總次數(shù)趨勢白天和夜晚增多高于飲水狀態(tài)(p<0.001)，注射納洛酮后晝夜自主活動水平均下降(p<0.001)(Fig.4C)。

Fig.4.The locomotor activity for light-dark cycle was changed bye Nal of a representative rat in FP group (A,B). The locomotor activity for light cycle and dark cycle was decreased by Nal in FP rats(C)Nal: naloxone. Data represent M±SEM. n=15 per group. Differs from ad libitum water *p<0.05, **p<0.01. Differs from I.P saline #p<0.05, ##p<0.01.

以FP組大鼠飲水狀態(tài)下24h主動運動量為參照，計算出注射納洛酮前后主動運動比值。結(jié)果顯示，注射納洛酮后果糖喂養(yǎng)期間主動運動量增多(t(28)=-14.732，p<0.001)(Fig.5)。

3 討論

本研究中果糖偏好BED模型大鼠在一系列的果糖攝入量測試中表現(xiàn)出明顯的果糖喜好，并且在短時間攝入大量果糖溶液，符合食物成癮動物模型基本標(biāo)準(zhǔn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nal降低果糖BED大鼠果糖溶液和普通飼料的攝入量，同時還表現(xiàn)出自主活動水平的下降和主動運動行為的增強(qiáng)。

Fig.5.The change rate of voluntary exercise for 24h was decreased by Nal in FP rats.

本研究發(fā)現(xiàn)Nal抑制果糖偏好大鼠果糖溶液和食物的攝入，這與多數(shù)研究結(jié)果一致。激活阿片肽系統(tǒng)可快速增加攝食量和次數(shù)[17]，Nal是嗎啡樣物質(zhì)的特異拮抗劑，能競爭性阻止并取代嗎啡樣物質(zhì)與受體結(jié)合，阻斷嗎啡樣物質(zhì)的作用。Nal能夠降低阿片肽信號通路改變攝食偏好行為[18]。大鼠腦內(nèi)注射嗎啡后酒精和攝食量增多，而注射Nal可使酒精攝入量減少，但對攝食和飲水量沒有影響，注射DAMGO后刺激攝食，但對酒精攝入沒有作用[19]。這提示Nal阻斷阿片肽系統(tǒng)能對果糖成癮大鼠獎賞系統(tǒng)產(chǎn)生對食物非選擇性的抑制。

自主活動重復(fù)動作的增多，如搖頭和舔毛，也可以間接反映模型組大鼠存在一定戒斷癥狀，但本研究結(jié)果顯示此癥狀并不典型。垂直方向的自主活動主要代表大鼠站立的次數(shù)，也可以間接反映大鼠吮舔活動的增多。站立活動增多通常反應(yīng)大鼠處于焦慮狀態(tài)，提示本研究模型組大鼠存在類成癮行為的特征。自主活動的變化并不與能量平衡調(diào)節(jié)相一致[20]。肥胖?jǐn)z食增多往往伴有顯著的自主活動減退[21]，而毒品引起的成癮卻表現(xiàn)為自主活動增多[22]。阿片肽受體負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)自主活動的基礎(chǔ)信號水平，并與其他神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)一同維持長期的效應(yīng)[23]。阿片肽能神經(jīng)元興奮水平升高導(dǎo)致焦慮行為[24]，而在焦慮狀態(tài)下大鼠的自主活動會增加。嗎啡誘導(dǎo)自主活動增多，另一種阿片肽受體拮抗劑納美芬能在短時間內(nèi)反轉(zhuǎn)自主活動行為[25]。綜合分析，阻斷阿片肽系統(tǒng)獎賞機(jī)制后果糖偏好大鼠的自主活動行為有所好轉(zhuǎn)。從行為學(xué)角度分析，果糖偏好大鼠自主活動中重復(fù)動作的變化說明模型大鼠在果糖條件下存在成癮的焦慮狀態(tài)，而Nal降低了果糖成癮大鼠的焦慮水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，Nal可以抑制果糖成癮大鼠飲用果糖溶液時的自主活動同時增強(qiáng)自主運動行為。自主運動也表現(xiàn)為自愿進(jìn)行的主動運動，是一種更為復(fù)雜形式的運動，正常情況下許多種類的動物在沒有獎賞的條件下也具有很強(qiáng)烈的主動運動行為[26]。動物實驗發(fā)現(xiàn)主動轉(zhuǎn)輪運動可以做為獎賞的動機(jī)，大鼠能形成通過按壓的行為方式獲得轉(zhuǎn)輪[27]。人類中也發(fā)現(xiàn)存在運動成癮或運動依賴的現(xiàn)象，說明運動與獎賞系統(tǒng)存在復(fù)雜的聯(lián)系[28]。習(xí)慣從事轉(zhuǎn)輪運動的小鼠存在對轉(zhuǎn)輪運動可變的獎賞閾值，實驗發(fā)現(xiàn)使用可卡因可以增加正常小鼠的自主運動行為，但卻降低了過度運動小鼠的運動行為[29]。大鼠主動運動行為的增多會伴有攝食的減少和體重下降，這一現(xiàn)象也被稱為運動性厭食[30]。主動運動與成癮行為在中樞內(nèi)存在重疊的調(diào)控區(qū)域[31]。大鼠進(jìn)行主動轉(zhuǎn)輪運動降低位置偏好測試嗎啡的獎賞作用[32]，而耐力運動也可以增加內(nèi)源性阿片肽的釋放[33]。綜合本研究實驗結(jié)果，可以推測攝食成癮行為與自主活動和主動運動行為在中樞系統(tǒng)可能存在相互增強(qiáng)或抑制的調(diào)控機(jī)制，這是否可以解釋肥胖人群過度攝食但運動行為意愿下降還需要進(jìn)一步的研究。

4 小結(jié)

阿片肽系統(tǒng)參與果糖偏好大鼠果糖的獎賞效應(yīng)下自主活動增多、主動運動行為抑制的中樞調(diào)節(jié)過程。