復方紅豆杉膠囊對人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型抗腫瘤活性及其作用機制的研究*

鐘 慧 劉利英 任曉紅 黨 潔 渠淑云 周衛(wèi)東

（1.陜西省核工業(yè)215醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西省榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 718000）

卵巢癌是女性生殖器癌癥中病死率較高的惡性腫瘤之一，盡管目前患者的治療效果及生存率有所提高，但由于卵巢癌具有易轉移復發(fā)、耐藥性較強等特點，患者的預后仍不樂觀，5年生存率不足40%[1-2]。因此，探索出一種有效的腫瘤藥物治療方法，提高卵巢癌的抗腫瘤效果，已成為目前研究的熱點。復方紅豆杉膠囊是臨床常用的抗腫瘤中藥制劑，具有祛邪散結等功效，主要用于中晚期肺癌化療的輔助治療[3]。盡管有少數(shù)研究結果顯示復方紅豆杉膠囊中主要成分紅豆杉水提取物對卵巢癌細胞具有較好的抑制作用，但體內實驗卻尚未開展，而該藥物用于卵巢癌臨床治療的相關研究則更是鮮有報道[4]。為此，筆者對復方紅豆杉膠囊用于人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型的抗腫瘤作用進行了研究，并對其主要機制進行了探討，期望為卵巢癌的治療及該藥物的新型臨床使用提供思路與方法?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

CN-1r型多管架高速自動離心機 （美國安捷倫公司）；NM-09型顯微照相系統(tǒng)、Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)及Quantity-One軟件 （日本奧林匹斯公司）；TB-718型生物組織包埋機（武漢安達科技實業(yè)有限公司）；HM325型石蠟切片機 （德國米克公司）；Trans-Blot Turbo全能型半干式免疫蛋白轉印系統(tǒng)（德國安義生物科技有限公司）。

1.2 藥物及試劑

復方紅豆杉膠囊（重慶賽諾制藥有限公司，批號：2016010291）；陽性藥環(huán)磷酰胺片（通化茂祥制藥有限公司，批號：2017012309）；羧甲基纖維素鈉（美國SIGMA 公司，批號：91092317）；β-actin（武漢博士德生物技術有限公司，批號：2017031209）；一抗 C型-半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（C-caspase-3）抗體、多重腫瘤抑制因子（MTS）抗體、B淋巴細胞瘤-2（BCL-2）抗體及細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK4）抗體（美國SIGMA 公司；批號依次為：11646811、11664671、11463467 及 11574578）， 二 抗 C-caspase-3、MTS、BCL-2及CDK4抗體 （美國SIGMA公司；批號依次為：19803461、18928745、 19804826 及 10987467），微量BCA蛋白定量試劑盒 （武漢博士德生物科技有限公司，批號：2015112109）。

1.3 實驗細胞與動物

1.3.1 實驗細胞 人卵巢癌SKOV3細胞購自陜西省疾病控制中心，批號：201610-2，將SKOV3細胞置于含100 U/mL青霉素、10%胎牛血清及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用生理鹽水沖洗，并制備單細胞懸液，將細胞密度調整至1×107/mL備用。

1.3.2 實驗動物 40只清潔級BALB/cA-nude雌性裸小鼠購自陜西省疾病控制中心，動物使用許可證號：SCXK（陜）2016-0892，鼠齡 6～8 周，體質量 18～22 g。所有小鼠飼養(yǎng)條件為晝夜各半，食物飲水不限制，室溫，55%濕度。

1.4 分組與造模[5]

各組小鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為模型對照組、環(huán)磷酰胺組、復方紅豆杉膠囊低劑量組及復方紅豆杉膠囊高劑量組，每組10只。將細胞密度為1×107/mL的SKVO3細胞懸液接種于裸小鼠胸壁皮下，細胞懸液接種量為0.2 mL，待腫瘤生長至100～250 mm3時即為建模成功。

1.5 給藥方法

根據(jù)復方紅豆杉膠囊及環(huán)磷酰胺的人體治療劑量，并結合文獻[6]中人體與動物的劑量轉換公式來確定本研究中小鼠的治療劑量。小鼠給藥劑量（mg/kg）=12.3×成人劑量（mg/kg），成人體質量以 60 kg 計，復方紅豆杉膠囊及環(huán)磷酰胺的人體一般劑量分別為1.8 g/d和 0.15 g/d， 換算成小鼠劑量分別為 0.369 g/（kg·d）和0.031 g/（kg·d），選取復方紅豆杉膠囊的一般給藥劑量為紅豆杉低劑量組 [0.369 g/（kg·d）]，2 倍一般給藥劑量為紅豆杉高劑量組[0.74 g/（kg·d）]。 將未成功建模或死亡的小鼠剔除后，對剩余小鼠進行給藥，紅豆杉低、高劑量組小鼠分別給予0.369、0.74 g/kg的復方紅豆杉膠囊灌胃，而其余組則予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥14 d。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 一般情況 末次給藥24 h后，采用脫頸法將小鼠處死，取其皮下腫瘤組織，檢測小鼠腫瘤組織長短徑及瘤體質量，計算腫瘤體積與腫瘤抑制率，其中腫瘤抑制率=（模型對照組腫瘤體積－給藥組腫瘤體積）/模型對照組腫瘤體積×100%；腫瘤體積=[（長徑×短徑2）/2（mm3）]。

1.6.2 腫瘤組織病理切片 將上述小鼠的腫瘤組織平均分為6部分，取其中一部分，采用4%多聚甲醛液固定，依次經過石蠟包埋、蘇木素/伊紅（HE）染色、連續(xù)切片、烤片與封片處理后觀察其病理組織學變化。

1.6.3 采用免疫熒光染色方法檢測腫瘤組織中C-caspase-3、MTS、BCL-2及CDK4表達量 取4份上述腫瘤組織樣本，根據(jù)試劑盒說明書中免疫熒光染色方法對 C-caspase-3、MTS、BCL-2及 CDK4的表達量進行檢測：采用石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復、一抗結合、二抗結合、復染及封片，并將封好的切片置于熒光顯微鏡中，對其進行拍照，采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件統(tǒng)計小鼠腫瘤組織中的陽性信號數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 復方紅豆杉膠囊對卵巢癌小鼠腫瘤病灶一般情況的影響

見表1。造模過程中，模型對照組及環(huán)磷酰胺組均成功造模且無小鼠死亡，而紅豆杉高劑量組及低劑量組均出現(xiàn)1只小鼠造模失敗但無小鼠死亡。與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組腫瘤體積與腫瘤質量均顯著降低（P＜0.05）。與環(huán)磷酰胺組比較，模型對照組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組腫瘤體積與腫瘤質量均顯著增高，而紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組腫瘤生長抑制率均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠腫瘤病灶一般情況比較（±s）

表1 各組小鼠腫瘤病灶一般情況比較（±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05。下同。

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2.2 復方紅豆杉膠囊對卵巢癌小鼠腫瘤病灶病理學檢查的影響

見圖1。HE染色結果顯示，模型對照組腫瘤病灶中癌細胞形態(tài)與染色均正常，結構完整且大小均勻。環(huán)磷酰胺組腫瘤病灶中癌細胞出現(xiàn)大面積凋亡及壞死，而紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組小鼠腫瘤病灶中癌細胞亦出現(xiàn)壞死，但壞死程度均不及環(huán)磷酰胺組。

2.3 熒光免疫組化法檢測小鼠 C-caspase-3、MTS、Bcl-2及CDK4的表達情況

圖1 小鼠腫瘤組織病理學檢查結果（HE染色，200倍）

見表2。熒光免疫組化染色中，C-caspase-3、MTS、Bcl-2及CDK4陽性均呈現(xiàn)橙紅色分布于腫瘤細胞中，且呈彌漫性或顆粒狀分布。熒光免疫組化結果表明，模型對照組小鼠腫瘤病灶中Bcl-2及CDK4均呈弱陽性或無明顯表達，而C-caspase-3及MTS均呈強陽性；環(huán)磷酰胺組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組小鼠腫瘤組織中Bcl-2及CDK4的陽性表達均呈弱陽性或無明顯表達，而C-caspase-3及MTS的陽性表達均呈強陽性。見圖2～圖5。半定量分析結果表明，與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組Bcl-2及CDK4相對表達量均明顯降低，而C-caspase-3及MTS相對表達量均明顯增高 （P＜0.05）。與環(huán)磷酰胺組比較，模型對照組、紅豆杉高劑量組及紅豆杉低劑量組Bcl-2及CDK4相對表達量均明顯增高，而C-caspase-3及MTS相對表達量均明顯降低（P＜0.05）。

表 2 各組小鼠 Bcl-2、CDK4、C-caspase-3及 MTS熒光免疫組化相對表達量比較（±s）

表 2 各組小鼠 Bcl-2、CDK4、C-caspase-3及 MTS熒光免疫組化相對表達量比較（±s）

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圖2 小鼠腫瘤組織中Bcl-2的表達情況（熒光免疫組化染色，400倍）

圖3 小鼠腫瘤組織中CDK4的表達情況（熒光免疫組化染色，400倍）

圖4 小鼠腫瘤組織中C-caspase-3的表達情況（熒光免疫組化染色，400倍）

圖5 小鼠腫瘤組織中MTS的表達情況（熒光免疫組化染色，400倍）

3 討 論

卵巢癌是臨床常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，手術及化療是該疾病的主要治療方法，盡管上述治療手段均較為成熟可靠，但部分老年患者及晚期患者無法耐受手術治療，化療則存在著全身藥物不良反應較大、易出現(xiàn)耐藥性等缺點，而中藥因其具有全身毒副作用小、療效確切及多靶點調控等優(yōu)點在臨床中備受重視[7-8]。復方紅豆杉膠囊主要由紅豆杉、紅參及甘草等中藥材所組成，具有活血祛瘀、消腫散結等功效，臨床常用于肺癌等多種惡性腫瘤的輔助治療[9]。現(xiàn)代藥學研究結果表明，該藥物中主要成分紅豆杉水提取物具有較好的抗腫瘤活性，在體外對于乳腺癌細胞等惡性腫瘤細胞的增殖具有較強的抑制活性[10]。盡管復方紅豆杉膠囊的抗癌效果已被臨床普遍認可，但將其用于乳腺癌治療的研究卻基本未見開展，鑒于該藥物具有較好的抗乳腺癌物質基礎，筆者采用人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型，探討了復方紅豆杉膠囊對卵巢癌的抗腫瘤效果，并對其作用機制進行了闡述，期望為該藥物的新應用提供依據(jù)。

細胞凋亡指的是由基因編碼所調控的細胞主動自殺，又被稱為程序性細胞死亡，該過程既是消除機體異常增殖細胞的理想途徑，也是生物體維持自身穩(wěn)定的一個重要機制，惡性腫瘤細胞的增殖與凋亡的失衡在癌癥的發(fā)展過程中起到至關重要的作用[11]。研究結果表明，C-caspase-3是機體中重要的促進細胞凋亡因子，在蛋白酶級聯(lián)切割作用中處于核心位置，該蛋白被激活會造成腫瘤細胞大量死亡[12]。Bcl-2能夠提高細胞中線粒體膜電位水平，抑制C-caspase-3蛋白的表達與活化，從而阻滯C-caspase-3的促癌細胞凋亡作用[13]。MTS可有效調節(jié)細胞周期G1期的發(fā)展進程，并可對CDK4的表達起到負調節(jié)作用，從而促進癌細胞的凋亡[14]。CDK4則可造成腫瘤細胞凋亡異常，導致細胞平衡紊亂而引起癌細胞呈惡性生長趨勢[15]。由此可見，C-caspase-3、MTS、Bcl-2 及 CDK4 均是有效反映卵巢癌細胞凋亡的關鍵蛋白，對于探討藥物對卵巢癌的治療效果及其作用機制具有重要意義。

在本研究中，高劑量及紅豆杉低劑量組小鼠病灶體積及腫瘤質量均顯著低于模型對照組，且病理學觀察結果顯示腫瘤組織中均可見不同程度的癌細胞凋亡，提示復方紅豆杉膠囊可有效抑制卵巢癌腫瘤組織的增長。進一步研究結果顯示，紅豆杉高劑量組及低劑量組小鼠腫瘤組織中Bcl-2及CDK4相對表達量均明顯低于模型對照組，而C-caspase-3及MTS相對表達量均明顯高于模型對照組，提示復方紅豆杉膠囊具有較好的促腫瘤細胞凋亡活性，該作用可能是其具有較好抗腫瘤活性的主要機制之一。

綜上所述，復方紅豆杉膠囊對人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型具有良好的治療作用，且其主要機制可能與該藥物促進腫瘤細胞凋亡有關，值得進行深入研究。然而本研究中仍存在藥物具體機制探討不清等問題，后期還需進一步完善。此外，由于小鼠與人體的實際情況存在著一定的差別，故本研究的實驗結論是否適用于臨床還需要進行深入的驗證。