針刺捻轉(zhuǎn)補瀉手法對SHR海馬Ach、M1含量的影響*

楊芳媛 劉清國

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，高血壓的發(fā)病率持續(xù)升高，并呈年輕化趨勢[1]。高血壓除了帶來沉重的社會與家庭負擔外，也對個人產(chǎn)生了身心方面的壓力。高血壓屬最常見的慢性病之一，如發(fā)病年齡越小，其病程越長，對心、腦、腎及血管等的不利影響也愈加嚴重[2]。除此之外，高血壓還會誘發(fā)其他疾病的發(fā)生發(fā)展。

海馬在學習[3]、記憶力[4]、認知[5]、注意力[6]、精神情緒調(diào)節(jié)[7]、空間定位方面有重要的作用，對海馬進行刺激后會影響外周自主神經(jīng)的活動，外周傳入的信息也會作用于它，海馬是組成中樞自主神經(jīng)活動調(diào)控系統(tǒng)的重要部分。研究發(fā)現(xiàn)：捻轉(zhuǎn)補瀉手法對應激性高血壓大鼠下丘腦中NOS-1基因和蛋白表達有影響；可以通過Ach-NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控血壓。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，以自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）[8]模型為研究平臺，分析探討捻轉(zhuǎn)補瀉手法對SHR的海馬區(qū)的效應及機制，并通過RT-PCR及ELISA方法檢測海馬區(qū)間乙酰膽堿（Ach）、毒蕈堿型受體（M1），分析捻轉(zhuǎn)補瀉手法對海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的影響為以后補瀉手法的機制研究提供思路和線索，為探索新的高血壓防治靶點提供理論依據(jù)，為提升高血壓防治有效率提供可靠的技術(shù)方法?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級，SHR40只，WKY大鼠10只雄性，9周齡，體質(zhì)量（210±15）g，實驗動物均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）200223。實驗中使用的動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院針灸生物學實驗室（國家二級實驗室）。實驗期間，室溫控制在（20±1）℃，濕度控制在50%左右，飲食飲水自由，紫外線定期消毒，定期更換飼料、墊料、水。實驗中使用的大鼠飼料、墊料均由北京維通利華公司提供。實驗中所有程序均遵守動物實驗國際倫理準則，并且得到了北京中醫(yī)藥大學動物保護與使用委員會的批準（批準號：BUCM-3-2016090301-3003）。

1.2 試藥與儀器

中研太和牌針灸針（規(guī)格：直徑0.18 mm，長度13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司），BP-6無創(chuàng)血壓儀（成都泰盟科技有限公司），一次性注射器（山東頤興醫(yī)療器械有限公司），ACS-XM計重電子秤 （上海升亮電子科技有限公司），醫(yī)用棉球（揚州亞申科技有限公司），紗布塊（江西康衛(wèi)器械設(shè)備有限公司），全自動多功能酶標儀（MULTISKAN MK3，Thermo，USA），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A，天津泰斯特），MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），高速冷凍離心機（Beckman Allgre 21R），電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽 （北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），凝膠成像儀（BioSens SC 810B，上海山富科學儀器有限公司），分光光度計（UV-2000，上海菁華科技有限公司），實時定量 PCR 儀（ABI7500，USA）。

1.3 動物分組

WKY大鼠10只作為空白組對照。SHR經(jīng)篩選后，隨機分為模型組、針刺組、捻轉(zhuǎn)補法組、捻轉(zhuǎn)瀉法組，每組10只。

1.4 干預方法

1）空白組與模型組抓取固定不針刺。2）針刺組取“太沖穴”（雙側(cè)），取穴參照《實驗針灸學》[9]：于后肢足背1、2趾骨間凹陷處取“太沖穴”。只針刺不施行手法。3）捻轉(zhuǎn)補法組：取穴同針刺組。將大鼠固定于鼠套中之后，毫針直刺1～2 mm，留針20 min；予針刺補法：右手為刺手針刺后，施行手法，拇指向前重捻，輕退回。手法幅度為 360°/次，60 次/min，持續(xù)捻轉(zhuǎn) 3 min。 4）捻轉(zhuǎn)瀉法組：取穴同針刺組。將大鼠固定于鼠套中之后，毫針直刺1～2 mm，留針20 min；予針刺瀉法：以右手為刺手針刺后，施行手法，拇指向后重捻，輕退回。手法幅度為 360°/次，60 次/min，持續(xù)捻轉(zhuǎn) 3 min。各組治療 27 d，每隔6 d休息1 d，每日下午治療1次。所有針刺操作均由同一人完成。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 血壓測量 將大鼠于36℃下預熱約15 min，連續(xù)3次測量大鼠尾壓，取均值。于開始針刺前1 d測量血壓 1次，針刺治療開始后，于針刺的第 3、8、13、18、23、27日測量血壓值。注意：測壓過程動作要輕柔，不能激惹大鼠，以免引起血壓波動。

1.5.2 實驗取材 在實驗的第28天下午，將所有大鼠用100 g/L的水合氯醛麻醉后，斷頭處死，于冰塊上取出海馬組織，經(jīng)液氮固定后，放置于-80℃的冰箱進行保存。

1.5.3 ELISA檢測Ach 在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應?？筛鶕?jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。

1.5.4 RT-PCR檢測M1 合成引物，引物AchRM1R F，引物序列（5′to 3′）為 CCTGCTGTCAGTCCCAACAT；引物 AchRM1R R，引物序列（5′to 3′）為GAGCTCG-GTGTTGACCTTGA。提取樣本總RNA，將RNA模板、引物、5xRT mix和RNase-free Water溶解并置于冰上備用，混勻，孵育5 min，迅速冰浴2～10 min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。繼續(xù)向以上反應液中加入試劑5xRT Mix和HiFi-MMLV Enzyme Mix，輕輕吸打混勻，37℃孵育40 min。反應結(jié)束后70℃保溫10 min。用ABI7500熒光定量PCR儀，采用2-△△ct方法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠收縮壓比較 見表1。針刺前，空白組的血壓與模型組、針刺組、補法組和瀉法組之間有明顯差異（P＜0.05），4個由SHR組成的組之間無明顯差異（P＞0.05）。在實驗干預后，組間的差異表現(xiàn)為：空白組和模型組的收縮壓均有上升（P＜0.05）；針刺組的收縮壓也有上升（P＜0.05），但是比空白組和模型組的升勢緩；捻轉(zhuǎn)補法組和捻轉(zhuǎn)瀉法組的收縮壓呈下降趨勢（P＜0.05），且瀉法組收縮壓下降趨勢較補法組更明顯（P＜0.05）。組內(nèi)的差異表現(xiàn)為：從第8日起，空白組、模型組、針刺組、捻轉(zhuǎn)補法組、捻轉(zhuǎn)瀉法組與針刺前1 d比較有顯著差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠收縮壓變化比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠收縮壓變化比較（mmHg，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與針刺組比較，▲P＜0.05；與捻轉(zhuǎn)補法組比較，◇P＜0.05

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2.2 各組大鼠海馬中Ach、M1表達比較 見表2。針刺干預后，Ach含量空白組與模型組、針刺組、補法組、瀉法組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組與針刺組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），針刺組與空白組、瀉法組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），瀉法組與補法組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。M1含量空白組與模型組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），針刺組與補法組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），瀉法組與補法組、針刺組、模型組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），瀉法組與空白組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠海馬中Ach、M1含量變化比較（±s）

表2 各組大鼠海馬中Ach、M1含量變化比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與捻轉(zhuǎn)補法組比較，△P＜0.05

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3 討 論

本研究采用SHR作為模型組和干預組，因為SHR的血壓升高是由多基因遺傳決定的，與人類高血壓病十分類似，是研究高血壓病發(fā)病機制和篩選降壓藥物較為理想的動物模型。WKY大鼠是自發(fā)性高血壓大鼠的對照品系，所以選擇其作為空白組。

針刺補瀉的基本原則見于《靈樞》[10]中“凡用針者，虛則實之，滿則瀉之，宛陳則除之，邪勝則虛之”。機體可將捻轉(zhuǎn)補瀉所產(chǎn)生的不同刺激信號轉(zhuǎn)化為生物學信號，通過神經(jīng)內(nèi)分泌、細胞因子、信號轉(zhuǎn)導通路、神經(jīng)放電等方式參與生命活動的調(diào)節(jié)。

海馬參與血壓的調(diào)控[11]主要通過兩方面進行：一是通過神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)通路產(chǎn)生聯(lián)系，調(diào)控血壓，二是直接與神經(jīng)通路相關(guān)組織發(fā)生聯(lián)系調(diào)控血壓。海馬區(qū)的主要神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[12]有5-HT、Ach等系統(tǒng)以及海馬組織自身受體在突觸前調(diào)制中的作用。與海馬區(qū)相關(guān)的神經(jīng)通路組織有腦干的孤束核（NTS），其參與調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)[13]。NTS是內(nèi)臟的初級傳入中樞與基本反射中樞，多接受來自于心血管、胃腸系統(tǒng)等的信息。海馬傳出的纖維可以傳到PVN、內(nèi)側(cè)額葉皮質(zhì)（MFC）等腦區(qū)，這些腦區(qū)又能直接投射到NTS，所以這些腦區(qū)可以算是海馬和NTS之間的中繼站。海馬調(diào)控心血管反應可以通過CA1區(qū)的神經(jīng)元投射到MFC，再通過MFC投射到NTS。存在于NTS的膽堿能神經(jīng)元經(jīng)多個通路可以投射到海馬的CA1區(qū)。Ach是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一[14]，中樞能膽堿系統(tǒng)與學習、記憶、血壓[15]密切相關(guān)。Ach可使全身血管擴張，也包括肺血管和冠狀血管[16]。其擴血管作用主要由于激動血管內(nèi)皮細胞膽堿受體亞型，引起NO釋放，NO可以通過通路對心血管活動產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，抑制交感興奮性，引起鄰近平滑肌細胞松弛，從而降低血壓[17]。毒蕈堿型受體是乙酰膽堿的受體，當Ach與這類受體結(jié)合后，可產(chǎn)生一系列副交感神經(jīng)末梢興奮地效應，包括心臟活動的抑制，胃腸道平滑肌的收縮，以及消化腺分泌增加等。毒蕈堿型受體在中樞主要有3種亞型，在中樞主要分布的是 M1 受體[18]。

在本實驗中，針刺前，空白組的血壓與模型組、針刺組、補法組和瀉法組之間有差異（P＜0.05），4個SHR大鼠組之間無明顯差異（P＞0.05）。在實驗干預后，組間的差異表現(xiàn)為：空白組和模型組的收縮壓均有上升（P＜0.05）；針刺組的收縮壓也有上升（P＜0.05）但是比空白組和模型組的升勢緩；捻轉(zhuǎn)補法組和捻轉(zhuǎn)瀉法組的收縮壓呈下降趨勢（P＜0.05），且瀉法組收縮壓下降趨勢較補法組更明顯。組內(nèi)的差異表現(xiàn)為：從第8天起，空白組、模型組、針刺組、捻轉(zhuǎn)補法組、捻轉(zhuǎn)瀉法組與針刺前1 d比較有顯著差異（P＜0.05）。大鼠血壓組間的差異顯示出針刺捻轉(zhuǎn)補瀉手法對血壓的調(diào)控有明顯的作用[19]，其中以捻轉(zhuǎn)瀉法的作用更為明顯[20]。組內(nèi)之間的差異是由于每日對其進行抓取固定，這屬于一種刺激，會引起大鼠的應激發(fā)應，從而造成血壓升高。

針刺干預后，Ach含量補法組、針刺組、模型組、空白組之間有差異（P＜0.05），瀉法組與模型組之間有差異（P＜0.05），瀉法組與補法組、針刺組之間有差異（P＜0.05），模型組與空白組之間有差異（P＜0.05）。 M1含量補法組、針刺組、模型組、空白組之間有差異（P＜0.05），瀉法組與補法組、針刺組、模型組之間有差異（P＜0.05）。分析其原因，應該是針刺捻轉(zhuǎn)補瀉手法可以增多Ach、M1的釋放，通過Ach-M1-抑制NA釋放-降低血壓，Ach-M1-NO-GCMP-降低血壓這兩條通路來進行血壓的調(diào)控。

綜上所述，通過針刺“太沖”穴，并施加捻轉(zhuǎn)瀉法的干預，自發(fā)性高血壓大鼠的血壓明顯降低。實驗大鼠經(jīng)過針刺捻轉(zhuǎn)補瀉手法刺激后，海馬組織中Ach、M1的含量均升高，針刺捻轉(zhuǎn)瀉法可促進SHR大鼠海馬組織內(nèi)降壓神經(jīng)遞質(zhì)的生成，通過升高自發(fā)性高血壓大鼠Ach、M1、NO的含量，可激活鳥苷酸環(huán)化酶，使鈣離子水平降低，導致血管緊張性降低，達到降壓的目的。