不同世代玉米株系及雜交種籽粒產(chǎn)量和顏色研究

馮漢宇，張秀海，劉貴明，張曉東

（北京市農(nóng)林科學院，北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心，北京 100097）

玉米除常見的白色和黃色品種外，還有黑、紅、藍和粉色等單色類型以及雜花色彩色玉米。玉米籽粒顏色屬質量性狀，由果皮、胚乳和胚的顏色共同組成。普通的黃色和白色玉米品種，其果皮和糊粉層均為無色的，黃色產(chǎn)生在胚乳上；而其他顏色的玉米品種，籽粒顏色均產(chǎn)生在糊粉層或果皮上。玉米果皮厚度為40-250μm，果皮細胞的層數(shù)介于2-18層之間。每層細胞厚度大約為18μm，果皮呈現(xiàn)出紅、棕、花斑和白色4種表現(xiàn)型[1]。胚乳由糊粉層和淀粉層組成，其中，糊粉層是僅由幾層細胞組成的薄且具有一定透明度的組織，一般玉米的糊粉層是無色的，但在特殊的遺傳背景下可以形成黑、藍、紫、紅和棕色等；淀粉層顏色呈現(xiàn)出深黃、淺黃和白色等[2]。胚在玉米籽粒中一般占10% 左右，胚尖顏色有紫色和白色2種表現(xiàn)型[3]。

花青素是存在于植物中的水溶性色素，由一個基本的結構母核和不同的取代基組成，因取代基種類及位置的不同而形成了不同的顏色，包括粉、紅、紫和藍色等，大約88% 的被子植物的花色是由花青素決定的[4，5]。苯丙氨酸是類黃酮類生物合成的直接前體，細胞質中苯丙氨酸經(jīng)一系列的酶促反應合成花青苷?；ㄇ嘬盏幕竟羌芙Y構為2-苯基苯并吡喃，也稱為花青苷母核，經(jīng)不同的羥基化、糖基化、甲基化、?；揎椌托纬闪瞬煌幕ㄇ嗨?。其中，查爾酮合成酶、查爾酮異構酶和黃烷酮3-羥化酶是類黃酮代謝的關鍵酶，催化相應的底物反應可轉化為花青素及其它類黃酮物質[6]。花青素在結構上主要分為天竺葵素、矢車菊素和飛燕草三類。由矢車菊素和飛燕草素衍生出芍藥花素、碧冬茄素和錦葵素等花青素[7-9]。前人研究表明，紅色、紫色和黑色玉米中的花青素主要是矢車菊色素-3-葡萄糖苷[10-13]，粉色玉米中的花青素主要是天竺葵色素，這些色素與飛燕草素相比抗氧化能力均較弱，且僅在糊粉層分布[14]。

為了解決轉基因育種研究中受位置效應、基因沉默等因素影響很難得到純合株系，且還要耗費大量人力、物力和財力進行檢測的問題，以含花青素基因的玉米雜交后代（轉BI和CI的京501×京24）為試驗材料，連續(xù)多代自交授粉，篩選獲得多個花青素基因穩(wěn)定表達的新型自交系；然后，與常規(guī)自交系進行雜交或三交授粉，分析后代玉米籽粒的產(chǎn)量與顏色變化，旨為轉基因或常規(guī)玉米育種研究以及雜交種子的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試玉米材料為自交系京501、13號和鄭58，以及含花青素基因的雜交F2代（以轉BI和CI的自交系京501為母本、京24為父本雜交而成）。其中，京501自交系種子由北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心提供；13號自交系（FH661/S902選系）種子來自中國農(nóng)業(yè)大學；鄭58自交系種子來自北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心；含花青素基因的雜交F2代種子由北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心張立全提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 含花青素基因雜交F2代后代（即F3代）的獲得 2016年4月30日在北京市農(nóng)林科學院院內(nèi)試驗基地，將原來在倉庫中存放的自交系京501和鄭58以及含花青素基因的雜交F2代種子進行播種。播種前（4月28日）整地時，均勻施入三元復混肥（N、P2O5和K2O含量均為15% ，青上化工有限公司生產(chǎn)，下同）750 kg/hm2。玉米均采用60 cm等行距種植，株距25 cm（密度67 500株/hm2）。小區(qū)面積3 m2，2次重復。播后澆水，7月套袋自交授粉。玉米生育期，進行常規(guī)指標調(diào)查；9月收獲并考種，裸眼觀察粒色和軸色。

在考種時發(fā)現(xiàn)，含花青素基因雜交F2代的玉米穗上絕大部分籽粒為黑色，個別籽粒為紅色。于是，隨機選取3穗（1穗來自葉綠的F2代株系，其他2穗均來自葉紫的F2代株系）分裝于自封袋內(nèi)，標記后備播。其中，標記為27-1、28-2和29-3的種子來自葉綠的含花青素基因雜交F2代株系，標記為30-1、31-2和32-3的種子來自1個葉紫的含花青素基因雜交F2代株系，標記為34-2和35-3的種子來自另一個葉紫的含花青素基因雜交F2代株系。

1.2.2 含花青素基因雜交F2代后代（即F3代）株系的農(nóng)藝性狀 2016年11月在海南省三亞市崖城玉米研究中心基地進行播種。種植品種有自交系京501（CK）、鄭58和13號，以及含花青素基因雜交F2代的自交后代種子（27-1、28-2、29-3、30-1、31-2、32-3、34-2和35-3）。11月3日整地，并均勻施入三元復混肥750 kg/hm2。11月4日播種（播種前24 h將玉米種子浸泡于清水中，播種時部分種子已生根），采用大小行種植，大行距80 cm，小行距40 cm，株距25 cm（密度67 500株/hm2）。每個品種的播種小區(qū)面積為6-9 m2，2-3次重復。播完后，噴施莠去津和乙草胺進行封閉除草，并采取措施（用竹竿和塑料布把地塊圍起來，外圍安裝電貓）防治鼠害。2016年12月末-2017年1月初進行授粉，其中，鄭58和13號全部為人工授粉（用含花青素基因株系30和32與鄭58授粉，用含花青素基因株系27、28、32和34與13號授粉），其他品種有的為自然授粉、有的為人工授粉。

玉米生育期，記載散粉期和抽絲期，裸眼觀察葉片顏色，采用常規(guī)方法測定株高、穗位高和葉片數(shù)。2017年2月底，每個品種均從行中間（去掉邊行）收獲5穗，統(tǒng)計穗粒數(shù)，用天平稱量單穗重、百粒重和單穗產(chǎn)量；裸眼觀察籽粒顏色?？挤N穗大部分為自然授粉的，個別穗為人工授粉的。

在考種時發(fā)現(xiàn)，大部分玉米穗的籽粒為黑色，部分穗子（一部分為花青素株系與鄭58和13號的雜交種）的籽粒為紅、黑或藍色等。于是，將粒色為雜色的玉米穗用小袋子分裝，標記后備播。其中，標記為1-34-1-40的種子來自27-1，標記為1-41-1-44的種子來自28-2，標記為1-45-1-50的種子來自29-3，標記為1-51-1-55以及2-1和2-2的種子來自30-1，標記為2-3-2-8的種子來自31-2，標記為2-9-2-12的種子來自32-3，標記為2-13-2-15的種子來自34-2，標記為2-16的種子來自35-3。

1.2.3 含花青素基因雜交F3代后代（即F4代）株系的農(nóng)藝性狀 2017年4月在北京房山基地進行播種。種植品種有501自交系（CK）、13號自交系、鄭58自交系，F(xiàn)4代，鄭58×京501、13號×京501，32株系、30株系×鄭58，27株系、28株系、32株系、34株系×13號。4月3日澆水，4月6日整地后人工點播，2粒/穴。玉米行長5.0 m，行距60 cm，株距25 cm（種植密度67 500株/hm2）。由于出苗不齊，5月5日補種1次，同時進行除草和定苗。6月末-7月初進行授粉，京501自交系與花青素株系（1-37、1-44、2-3、2-6、2-7、2-9、2-10、2-13）自交。并用花青素株系的花粉與一些雜交種授粉，即：用1-36與32株系×鄭58的雜交種進行三交授粉一穗，與32株系×13號雜交種進行三交授粉一穗。雜交2次重復，三交授粉2穗。

玉米生育期，調(diào)查散粉期、抽絲期和葉片數(shù)，用尺子測量株高和穗位高。8月底收獲，取雜交F4代的套袋授粉穗上幾粒籽粒進行解剖觀察和鏡檢；每品種（1-37、1-44、2-3、2-6、2-7、2-9、2-10、2-13 和京501）均取樣5穗進行考種。這5穗的選擇依人工套袋授粉的籽粒顏色作為標準（自然授粉穗上的籽粒顏色與人工套袋授粉穗上的籽粒顏色盡量一致），大部分自然授粉，個別人工授粉。雜交種（鄭58×京501、30株系×鄭 58、32株系×鄭58、13號×京501、27株系×13號、28株系×13號、32株系×13號、34株系×13號）每個重復收獲5穗進行考種。用天平稱量單穗粒重和百粒重；用糧食水分儀測定籽粒的含水量，按照籽粒含水量13% 折算單穗產(chǎn)量；裸眼觀察籽粒顏色。

2 結果與分析

2.1 不同自交系植株的農(nóng)藝性狀

用一些材料作為轉基因研究的供體，需要了解材料本身的農(nóng)藝性狀特征。調(diào)查結果（表1）顯示，13號、京501和鄭58自交系的散粉、抽絲期為6月30日-7月5日，其中鄭58散粉、抽絲均最早；總葉片數(shù)為18或19片，3個自交系差別不大；株高為152-165 cm，穗位高46-62 cm，2個指標值均以京501最低、13號最高；葉片均為綠色，籽粒均為黃色，穗軸均為白色，3個自交系表現(xiàn)一致。

表1 鄭58、京501和13號自交系的農(nóng)藝性狀（2017年）Table 1 Agronomic traits of inbred lines Zheng 58，Jing 501 and No.13 in 2017

2.2 含花青素基因雜交F3代植株的農(nóng)藝性狀

調(diào)查結果（表2）顯示，雜交F3代株系的株高為224-266 cm，穗位高為86-98 cm，2個指標值均躍京501；葉片數(shù)17-19片，抽絲、散粉期為12月23-31日，與京501差異不大；穗軸紫色，籽粒黑色，僅個別玉米穗的籽粒出現(xiàn)紅色和藍色等顏色（圖1），與京501差異較大；穗粒數(shù)183-468粒，均躍京501；單穗重140-227 g，百粒重26-35 g，其中大部分株系的指標值躍京501；產(chǎn)量63-186 g/穗，均躍京501?？梢钥闯?，F(xiàn)3代株系不是很純。需要繼續(xù)種植。

2.3 含花青素基因雜交F4代植株的農(nóng)藝性狀

調(diào)查結果（表3）顯示，F(xiàn)4代株系的株高為144-219 cm，穗位高42-95 cm，除2-3的穗位外，其他株系的2個指標值均躍京501；葉片數(shù)17-19片，與京501差異不大；抽絲、散粉期為6月27日-7月5日，其中大部分株系的生育期較京501提前；籽粒顏色多樣，有紅色、藍色、綠色、黑色、棕色、橙黃色和花斑果皮等（圖2），與京501差異較大；穗粒重42-89 g，百粒重21-31 g，單穗產(chǎn)量43-93 g，其中大部分株系的指標值躍京501。

表2 含花青素基因雜交F3代植株的農(nóng)藝性狀（2016年，海南）Table 2 Agronomic traits of hybrid F3plants with anthocyanin gene

圖1 含花青素基因雜交F3代的玉米穗特征Fig.1 Characteristics of ears of hybrid F3plants with anthocyanin gene

表3 含花青素基因雜交F4代植株的農(nóng)藝性狀（2017年，北京房山）Table 3 Agronomic traits of hybrid F4plants with anthocyanin gene

圖2 含花青素基因雜交F4代的玉米穗特征Fig.2 Characteristics of ear of hybrid F4plants with anthocyanin gene

2.4 不同色彩玉米籽粒的解剖與顯微觀察

圖3 含花青素基因雜交F4代的籽粒顏色Fig.3 Kernels colors of ear of hybrid F4plants with anthocyanin gene

對雜交F4代套袋授粉穗上的一些籽粒進行色彩調(diào)查，結果（圖3）顯示，與京501的黃色籽粒相比，其籽粒顏色有紅、棕、黑、紫紅、紫黑和花斑等多種。對這些色彩籽粒進行解剖后發(fā)現(xiàn)，籽粒顏色主要發(fā)生在果皮和糊粉層上，其中，果皮表現(xiàn)出紅、棕、花斑和無色4種表現(xiàn)型，糊粉層表現(xiàn)出黑、藍、紅、紫黑、綠和棕色，淀粉層色澤呈現(xiàn)淺黃和白色。

在顯微鏡下，對不同顏色的雜交F4代玉米籽粒果皮和糊粉層進行觀察后發(fā)現(xiàn)，果皮顏色有紅、棕和花斑色（圖4），糊粉層顏色有紅、棕、藍、紫、綠和黑色（圖5）。京501籽粒的果皮、糊粉層顏色分別為灰色和灰黑色。

圖4 顯微鏡下不同色彩玉米籽粒的果皮顏色Fig.4 Pericarp colors of maize kernels with different colors under microscope

圖5 顯微鏡下不同色彩玉米籽粒的糊粉層顏色Fig.5 Aleurone layer colors of maize kernels with different colors under microscope

2.5 雜交種和三交授粉穗的籽粒產(chǎn)量構成及顏色

花青素株系與鄭58的雜交種，散粉、抽絲期與對照（鄭58×京501）差異不大；株高均高于對照；穗位高較對照略高或持平；單穗重、百粒重和單穗產(chǎn)量均高于對照；籽粒有黃色、黑色或紫色，與對照全部為黃色不同（表4）。花青素株系與13號的雜交種，散粉、抽絲期與對照（13號×京501）差異不大；株高均高于對照；穗位高較對照略高或持平；單穗重、百粒重和單穗產(chǎn)量均高于對照；籽粒有黃色、黑色或紅色，與對照全部為黃色不同。通過人工授粉我們可以看出，雜交授粉（用花青素株系花粉與鄭58和13號雜交）的穗子上雖然以黃色籽粒居多，但也有黑色、藍色和紫色籽粒，與對照（京501×鄭58、京501×13號）自然授粉籽粒全部為黃色不同；用花青素株系花粉與雜交穗人工三交授粉穗上籽粒有黑色、藍色、紫色和黃色，但是大部分籽粒為黑色和紫色，極個別為黃色或幾乎沒有黃色（圖6）。

表4 花青素株系與鄭58和13號雜交種的農(nóng)藝性狀均值Table 4 Agronomic traits average values of hybrids between strains with anthocyanin and Zheng 58 and No.13

圖6 單交種與三交授粉穗的特征Fig.6 Ear characteristics of cross hybrid and three-way pollination ears

3 結論與討論

3.1 結論

3.1.1 含花青素基因植株的農(nóng)藝性狀 依據(jù)雜交后代籽粒顏色性狀，經(jīng)過多代自交，得到一些穗上籽粒顏色一致的株系。雜交F4代的株高為144-219 cm，穗位高為42-95 cm，大部分株系的指標值高于京501；葉片數(shù)18片左右，與京501差異不大；抽絲、散粉期在6月27日-7月5日，大部分株系的生育期早于京501；穗部性狀與京501不同，籽粒顏色多樣，有紅、藍、黑、棕、橙黃色、花斑果皮等；大部分株系的單穗重、百粒重和產(chǎn)量高于京501。

3.1.2 玉米籽粒果皮和糊粉層的顏色 玉米籽粒顏色屬質量性狀，由果皮、胚乳和胚的顏色共同組成。通過對彩色玉米籽粒進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，果皮顏色有紅、棕、綠、黑、藍、紫、花斑等；用解剖刀解剖發(fā)現(xiàn)，籽粒顏色主要發(fā)生在果皮和糊粉層上，其中，果皮表現(xiàn)出紅、棕、花斑和無色4種表現(xiàn)型，糊粉層表現(xiàn)出黑、藍、紅、紫紅、紫黑和棕等顏色；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，黃、紅、棕、花斑籽粒的果皮在同一視野下顏色不同，黃、紅、棕、藍、紫、白和黑色糊粉層在同一視野下色澤也不一樣。

3.1.3 三交授粉雜交種和單交種的果穗籽粒色彩 花青素株系與鄭58和13號的雜交種，散粉、抽絲期與對照差異不大，株高和穗位略高，單穗重、百粒重和單穗產(chǎn)量較對照略高，籽粒顏色（有黃、黑、紅或紫色）與對照全部為黃色不同。三交授粉穗上的籽粒有黑、藍、紫和黃色，但是大部分籽粒為黑色和紫色，極個別黃色或幾乎沒有黃色，與對照以及花青素株系與鄭58和13號雜交種的籽粒大部分或全部是黃色不同?？梢钥闯觯闷渌伾挠衩鬃越幌祷ǚ叟c籽粒雜色的雜交組合授粉，能夠得到籽粒是彩色的玉米穗子。

3.2 討論

3.2.1 糊粉層顏色與CI位點 糊粉層顏色的性狀遺傳比較復雜，至少與5個基因位點有關，即A、Bz1、Bz2、C1和R1，其中A為花青素結構基因。C1是Paz-Ares在1987發(fā)現(xiàn)的玉米轉錄因子，位于玉米第9條染色體的短臂上C位點，編碼MYB類蛋白，在種子中以低水平轉錄，且只調(diào)控在種子粉糊層的花青素合成[15-18]；C1需要1個bHLH配體與1個WD40蛋白配體（PAC） 形成三元復合體 （MYB-bHLHWD40）以激活結構基因二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）和類黃酮3-葡糖基轉移酶基因（UFGT或BZ1）在種子粉糊層的轉錄[19-21]。C1可以被其等位基因MYB轉錄因子C1-1抑制，C端DNA結合區(qū)域的改變對于C1-1的抑制DFR和UFGT的轉錄作用均有重要的影響[22，23]。與京501的黃色籽粒相比，彩色玉米籽粒糊粉層表現(xiàn)出黑、紫紅和紫等顏色可能與C1有關，因為玉米種子中花青素合成途徑要依賴于MYB蛋白 （如 C1蛋白）和WD40蛋白 （如PAC1）形成MBW復合物共同發(fā)揮作用[24，25]。

3.2.2 果皮顏色與P1位點 與果皮顏色有關的基因為轉錄因子P1，P1可能調(diào)控玉米籽粒果皮花青素基因的表達[26-28]，其中，P1ww為白色果皮和白穗軸，P1wr為白色果皮紅穗軸，P1rr為紅果皮紅穗軸，P1mo為鑲嵌果皮和穗軸，P1vv為花斑果皮和穗軸[2]。玉米轉錄因子P1只和1個WD40蛋白配體（PAC）形成二元復合體激活結構基因DFR在種子果皮中表達，但是不能激活結構基因UFGT（BZ1）的轉錄。與京501的黃色果皮相比，彩色玉米籽粒果皮表現(xiàn)出紅、花斑等表現(xiàn)型可能與P1有關。

3.2.3 不同顏色玉米三交授粉制種以及彩色玉米的育種 目前，生產(chǎn)上最常用的是黃色玉米品種；白色、紅色和紫色玉米一般是鮮食糯玉米、甜玉米或爆裂玉米，普通彩色玉米不常見[2]。不同籽粒顏色的自交系之間雜交，雜交種籽?？赡苁请s色的；用其它顏色籽粒的自交系與籽粒雜色的組合授粉，授粉穗上籽粒是彩色的。所以，我們獲到籽粒彩色的穗子。然后，把不同色彩籽粒按照顏色分開種植，期望將來得到籽粒顏色一致的株系。當然，自然授粉與三交授粉的穗子由于無法做到授粉精確控制，致使穗上籽?？赡苁请s色的，不同于自交授粉的籽粒顏色一致的自交系穗子（圖7）。

圖7 自然或三交授粉與自交授粉穗的特征Fig.7 Characteristics of nature pollination，three-way pollination and self-pollination ears