尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)

王麗娟，萬(wàn) 明，安金剛

(1.中航工業(yè)西安醫(yī)院 皮膚科，陜西 西安710000;2.西安市北方醫(yī)院 皮膚科;3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 皮膚科)

尋常型銀屑病作為一種慢性炎癥性皮膚病，以皮膚瘙癢、干燥、紅疹等為主要臨床表現(xiàn)[1]，該病病因復(fù)雜，目前發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，且易復(fù)發(fā)[2]，給患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。研究表明[3]，角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖分化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫功能異常是尋常性銀屑病主要的病理基礎(chǔ)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[4]，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在皮膚正常生理代謝、炎癥反應(yīng)及炎癥性皮膚病中發(fā)揮重要作用。大麻素受體(cannabinoid receptor，CNR)作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，包括CNR1和CNR2兩個(gè)重要亞型，是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)重要組成，在調(diào)控內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與的各項(xiàng)生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。本研究為進(jìn)一步探討CNR在尋常性銀屑病發(fā)病中的作用，對(duì)患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)進(jìn)行分析，并探討其在評(píng)估疾病嚴(yán)重程度中的意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取2015年3月至2017年3月在我院皮膚科門(mén)診就診的尋常型銀屑病患者78例，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均具有典型的臨床癥狀，符合尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②本次發(fā)病前未進(jìn)行外用藥物或系統(tǒng)治療；③無(wú)免疫系統(tǒng)、結(jié)締組織、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾?。虎芙?月內(nèi)未使用過(guò)免疫抑制劑等影響免疫功能的藥物；⑤排除孕婦及哺乳期婦女。其中，男性43例，女性35例，平均年齡(31.5±6.7)歲，病程5個(gè)月-16年，平均(7.6±2.4)年，根據(jù)患者病程將患者分為靜止期和進(jìn)展期，其中，靜止期28例，進(jìn)展期50例。同期，從體檢中心選取45例健康者作為血清對(duì)照組，其中，男性26例，女性19例，平均年齡(32.4±7.0)歲，兩組在性別、年齡無(wú)差異(P>0.05)，均衡可比。同時(shí)，從手術(shù)室選取手術(shù)切除的正常皮膚組織40份作為皮膚對(duì)照組，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，其中，男性21例，女性19例，平均年齡(30.8±6.4)歲，與尋常型銀屑病患者在性別、年齡無(wú)差異(P>0.05)，均衡可比。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均行知情同意。

1.1.2主要試劑和設(shè)備 CNR1和CNR2檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海研盟生物工程有限公司，Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，CNR1、CNR2及內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)血清中CNR1和CNR2水平 所有尋常型銀屑病患者和血清對(duì)照組均采取晨起空腹靜脈血6 ml，4℃下于3 500 r/min離心20 min，留取血清，保存于-70℃以備檢。利用ELISA法檢測(cè)血清中CNR1和CNR2水平，所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室按照試劑盒說(shuō)明完成。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)組織中CNR1和CNR2基因表達(dá) 取尋常型銀屑病患者皮損組織和皮膚對(duì)照組正常皮膚組織，研磨后，加入細(xì)胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)組織中總RNA提取并檢測(cè)純度和濃度。取50 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。引物序列：CNR1：上游：5’-GAGCAAGGACCTGAGACATGC-3’，下游：5’-CTTAACAGTGCTCTTGATGCAGC-3’；CNR2：上游：5’-GACCGCCATTGACCGATACC-3’，下游：5’-GGACCCACATGATGCCCAG-3’； GAPDH：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，92℃ 30 s，53℃ 30 s，75℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算組織中CNR1和CNR2基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分 尋常型銀屑病患者就診時(shí)根據(jù)皮損面積和皮損嚴(yán)重程度對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分[7]：公式：PASI評(píng)分=(E頭+I頭+D頭)×A頭×0.1+(E上肢+I上肢+D上肢)×A上肢×0.2+(E軀干+I軀干+D軀干)×A軀干×0.3+(E下肢+I下肢+D下肢)×A下肢×0.4。其中，A：面積，E：紅斑，I：斑塊肥厚程度，D：鱗屑。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1尋常型銀屑病患者和血清對(duì)照組血清中CNR1和CNR2水平比較

尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 尋常型銀屑病患者和血清對(duì)照組血清中CNR1和CNR2水平比較

2.2不同病程尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比較

與血清對(duì)照組相比，進(jìn)展期和靜止期尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均升高，且進(jìn)展期高于靜止期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同病程尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比較

注：與血清對(duì)照組相比，aP<0.05；與靜止期相比，bP<0.05

2.3尋常型銀屑病患者和皮膚對(duì)照組皮膚組織中CNR1和CNR2表達(dá)比較

尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于皮膚對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 尋常型銀屑病患者和血清對(duì)照組血清中CNR1和CNR2水平比較

2.4不同病程尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)比較

與皮膚對(duì)照組相比，進(jìn)展期和靜止期尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，且進(jìn)展期高于靜止期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同病程尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)比較

注：與皮膚對(duì)照組相比，aP<0.05；與靜止期相比，bP<0.05

2.5尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)與PASI評(píng)分相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，尋常型銀屑病患者血清CNR1和CNR2水平均與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.412、0.435，P<0.05)，皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.324、0.406，P<0.05)。

3 討論

銀屑病是常見(jiàn)的皮膚慢性炎癥性疾病，與免疫系統(tǒng)功能異常密切相關(guān)，且病程遷延反復(fù)、尚無(wú)特效的治愈方法[8]，尋常型銀屑病是銀屑病中最常見(jiàn)類(lèi)型，約占銀屑病的90%以上[9]，由于該病病因及機(jī)制尚未完全清楚，已成為臨床研究重點(diǎn)。近年來(lái)，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在疾病發(fā)生及治療中的作用越來(lái)越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)[10]，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在應(yīng)激、疼痛、免疫、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)、腫瘤等多種腫瘤生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，在維持皮膚穩(wěn)態(tài)及調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡中起重要作用[11]。CNR作為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中關(guān)鍵性組成部分，在其功能發(fā)揮中發(fā)揮核心作用[12]，包括CNR1和CNR2兩種主要的類(lèi)型，CNR1主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，脾臟、皮膚、免疫細(xì)胞等外周器官及組織中也分布廣泛[13]，CNR2主要分布在脾臟、扁桃體等外周器官，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14]。陶科明等[15]指出，CNR1和CNR2在潰瘍性結(jié)腸炎中表達(dá)上調(diào)，可能參與了其發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究為進(jìn)一步探討CNR在尋常型銀屑病發(fā)生中的作用，對(duì)患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)進(jìn)行了分析。

本研究結(jié)果顯示，尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清對(duì)照組，且皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于皮膚對(duì)照組，說(shuō)明CNR1和CNR2在尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中表達(dá)水平升高，提示CNR1和CNR2可能參與了尋常型銀屑病發(fā)病過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，與血清對(duì)照組和皮膚對(duì)照組相比，進(jìn)展期和靜止期尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)水平均升高，且進(jìn)展期高于靜止期，說(shuō)明CNR1和CNR2可能與尋常型銀屑病患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，隨著尋常型銀屑病病情活躍程度增加，CNR1和CNR2表達(dá)量增加，提示CNR1和CNR2有望成為監(jiān)測(cè)患者病情的指標(biāo)。同時(shí)，本研究相關(guān)分析亦顯示，患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2水平均與PASI評(píng)分呈正相關(guān)，而PASI是反映銀屑病嚴(yán)重程度的指標(biāo)[16]，進(jìn)一步說(shuō)明CNR1和CNR2可能參與了患者病情進(jìn)展過(guò)程。

綜上所述，尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達(dá)升高，且與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，可能參與了患者病情進(jìn)展過(guò)程，有望為尋常型銀屑病機(jī)制研究及臨床治療提供新的方向和靶位。

作者簡(jiǎn)介：安金剛(1978-)，男，山東人，博士，副研究員，主要研究方向?yàn)樘貞?yīng)性皮炎，銀屑病。