重組脂聯(lián)素聯(lián)合辛伐他汀防治大鼠激素性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究

羅 兵 袁 毅 瞿剛波 袁 俊 郝攀登 曾智江 楊家福

SANFH多由患者激素服用劑量不當(dāng), 對(duì)股骨頭血供過(guò)程產(chǎn)生干擾, 進(jìn)而產(chǎn)生以股骨頭部分區(qū)段骨小梁與骨髓壞死為典型臨床特征的疾病。它是一種進(jìn)展性和致殘性疾病, 約有半數(shù)患者累及雙側(cè)股骨頭, 是對(duì)髖關(guān)節(jié)具有特殊破壞性的退行性病變, 最終導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)功能障礙, 嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。當(dāng)下, 關(guān)于脂聯(lián)素含量和骨代謝水平相關(guān)性的研究不斷增多, 深度也有所增加。因此, 本研究通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn), 利用辛伐他汀聯(lián)合細(xì)胞因子重組脂聯(lián)素治療早期大鼠激素性股骨頭壞死, 觀察其療效。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 取西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的無(wú)疾患的55只SD大鼠為研究對(duì)象, 按照治療方法的不同分為實(shí)驗(yàn)組(44只)與A組(11只)。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)組依照24.5 mg/kg劑量經(jīng)由大鼠腹腔穿刺注射醋酸潑尼松龍注射液, 1次/周；A組注射和實(shí)驗(yàn)組藥劑劑量等同的生理鹽水, 1次/周。兩組大鼠經(jīng)由6周注射后,從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選取40只大鼠隨機(jī)分為模型組(B組)、脂聯(lián)素組(C組)、辛伐他汀組(D組)和脂聯(lián)素+辛伐他汀組(E 組 ), 各 10只。D 組、E 組分別予以辛伐他汀 , 10 mg/kg,以1 ml生理鹽水溶解后灌胃, 1次/d。C組、E組大鼠予以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉, 在C臂引導(dǎo)下細(xì)針穿刺進(jìn)入髖關(guān)節(jié)腔, 將5 μg重組脂聯(lián)素注入髖關(guān)節(jié)腔內(nèi)。A組不作任何處理, B、D組以同樣的方法注射等量的生理鹽水。同時(shí)注射青霉素14萬(wàn)U/只。對(duì)五組大鼠毛發(fā)華潤(rùn)度、體重、活躍性以及食物攝入量等變化進(jìn)行觀察, 每周均要稱量其體重, 結(jié)合大鼠體質(zhì)情況對(duì)飼料所處方位進(jìn)行調(diào)整。經(jīng)6周注射治療后, 按照一定次序分別抽取大鼠10只/組, 致死后獲取股骨, 粗略觀察其形態(tài)、顏色, 進(jìn)行X線常規(guī)檢查,繼而度量股骨頭部分區(qū)段的骨密度。把剛剛獲取的股骨放進(jìn)10% 甲醛溶液中固定 24 h, 20% 甲酸脫鈣 3 d, 以細(xì)針穿刺順暢為脫鈣效果檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。從矢狀軸把股骨頭切開(kāi), 采用石蠟對(duì)切片行包埋處理, 對(duì)細(xì)胞學(xué)體態(tài)進(jìn)行觀察, 最后測(cè)算空骨陷窩率, 方法為在高倍顯微鏡下任意選擇每一切片10個(gè)高倍視野, 共計(jì)50個(gè), 空骨陷窩率=空骨陷窩/50個(gè)骨陷窩×100%。 對(duì)各組織切片SP法行免疫組化檢測(cè), 采用軟件分析法計(jì)算免疫組化陽(yáng)性匯集的光密度值。對(duì)各組織切片用SP法行VEGF免疫組化檢測(cè), 計(jì)算免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠一般情況 A組大鼠食物攝入量、睡眠時(shí)間無(wú)異常, 精神優(yōu)良, 對(duì)外界刺激反應(yīng)敏捷, 身體重量有所增加, 對(duì)抓取行為表現(xiàn)出一定反抗能力。B組大鼠食物攝入量降低, 精神狀態(tài)較差 , 對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩 , 明顯跛行, 毛發(fā)松散, 光澤較差, 抓取時(shí)抵抗無(wú)力。C組飲食睡眠正常, 精神尚可, 反應(yīng)稍遲鈍, 體重稍增加, 輕微跛行。D組飲食睡眠可,精神科, 反應(yīng)少遲鈍, 體重增加, 輕微跛行。E組飲食睡眠正常,精神好 , 反應(yīng)敏捷 , 體重增加 , 毛發(fā)不易脫落 , 體態(tài)基本正常。

2.2 五組大鼠股骨頭局部X線片情況 X線平掃結(jié)果提示A組大鼠股骨頭骨質(zhì)密度勻稱, 沒(méi)有產(chǎn)生典型異常。B組大鼠股骨頭以扁狀形態(tài)呈現(xiàn)出來(lái), 骨質(zhì)疏松, 骨小梁紊亂、中斷,有死骨形成。C組大鼠周股骨頭骨質(zhì)結(jié)構(gòu)輕度變扁, 骨質(zhì)疏松程度相對(duì)輕微, 骨小梁輕微紊亂, 可不間斷的觀察到點(diǎn)狀低密度影。D組大鼠股骨頭形狀大體上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常, 骨質(zhì)稍疏松, 骨小梁稍紊亂, 可見(jiàn)點(diǎn)狀低密度影。E組大鼠股骨頭形態(tài)正常, 骨質(zhì)稍疏松, 骨小梁連續(xù), 點(diǎn)狀低密度影較C、D組減少。

2.3 五組大鼠股骨頭局部骨密度比較 A、E組大鼠骨密度(0.1843±0.0032)、(0.1743±0.0140)g/cm2高于B、C、D組的(0.0899±0.0037)、(0.1299±0.0106)、(0.1375±0.0201)g/cm2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；A組大鼠骨密度略高于E組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 五組大鼠股骨頭局部骨密度比較(s, g/cm2)

表1 五組大鼠股骨頭局部骨密度比較(s, g/cm2)

注 ：與 A 組比較 , aP＜0.05 ；與 E 組比較 , bP＜0.05

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2.4 五組大鼠股骨頭組織病理學(xué)變化

2.4.1 標(biāo)本大體觀察 A組大鼠在參與本次研究整個(gè)過(guò)程中, 股骨頭光滑性與完整性均沒(méi)有發(fā)生改變；B組大鼠股骨頭產(chǎn)生塌陷, 關(guān)節(jié)軟骨被迫分離, 顏色變暗淡；C、D兩組大鼠股骨頭完整性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性基本沒(méi)有改變, 但是經(jīng)全面觀察后發(fā)現(xiàn)其光澤度降低, 顏色暗淡, 體現(xiàn)出灰白色, 沒(méi)有塌陷表征；E組大鼠股骨頭結(jié)構(gòu)完整性沒(méi)有破壞, 且光滑度逐漸增加, 色澤日趨常態(tài)化。

2.4.2 光學(xué)檢查結(jié)果 在光學(xué)顯微鏡下, A組大鼠骨小梁致密, 粗細(xì)適當(dāng) , 均勻排布, 時(shí)而會(huì)發(fā)現(xiàn)骨陷窩, 但仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)其內(nèi)骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)均未發(fā)生異常, 骨髓腔中脂肪細(xì)胞數(shù)目處于正常區(qū)間中；B組大鼠光學(xué)顯微結(jié)果提示骨小梁零散, 結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂 , 能夠觀察到碎片 , 空骨陷窩數(shù)目相對(duì)較多, 毛細(xì)血管散亂分布, 髓腔中脂肪細(xì)胞增生現(xiàn)象明顯, 發(fā)現(xiàn)纖維組織產(chǎn)生增生現(xiàn)象以及產(chǎn)生程度不一的炎性反應(yīng), 局部區(qū)段的骨小梁表層產(chǎn)生了新生骨組織。在骨小梁稀疏程度的比較中, C 、D、E組大鼠均較B組大鼠輕, 在空骨陷窩數(shù)量上也明顯少于B組大鼠。E組大鼠可見(jiàn)骨小梁有新生骨組織形成并增粗, 結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。

2.4.3 五組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較 E組空骨陷窩率(12.43±0.37)%低于B、C、D組的(28.84±1.16)%、(19.09±1.42)%、(17.99±0.73)%, 高于 A 組的 (9.10±0.72)%, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 五組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較(s, %)

表2 五組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較(s, %)

注 ：與 E 組比較 , aP＜0.05

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2.4.4 五組大鼠股骨頭組織TNF-α免疫組化IOD值比較A組大鼠TNF-α表達(dá)程度相對(duì)較弱, 只是在軟骨細(xì)胞胞漿內(nèi)局部表達(dá), C、D組TNF-α于骨細(xì)胞、造血細(xì)胞胞漿中均有不同程度的表達(dá)。E組TNF-α免疫組化IOD值(30722.46±11767.37)低于B、C、D組的(196085.20±47515.38)、(102341.65±43276.27)、(97140.39±36781.19), 高 于 A 組 的(20648.04±5518.97), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見(jiàn)表 3。

表3 五組大鼠股骨頭組織TNF-α免疫組化IOD值比較(s)

表3 五組大鼠股骨頭組織TNF-α免疫組化IOD值比較(s)

注 ：與 E 組比較 , aP＜0.05

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2.4.5 五組大鼠VEGF免疫組化表達(dá)比較 五組大鼠病理切片均可觀察到VEGF產(chǎn)生不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。E組股骨頭VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(37.46±5.40)高于B、C、D組的(16.20±5.30)、(30.65±6.20)、(31.39±3.70), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與A組的(37.04±4.50)比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。見(jiàn)表 4。

表4 五組大鼠VEGF免疫組化表達(dá)比較(s)

表4 五組大鼠VEGF免疫組化表達(dá)比較(s)

注 ：與 E 組比較 , aP＜0.05

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3 討論

目前激素的不合理應(yīng)用導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)病率已超過(guò)外傷所致的股骨頭壞死, 然而對(duì)于激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制尚有爭(zhēng)議［1］。脂肪栓塞學(xué)說(shuō)認(rèn)為由于激素蓄積引起血液粘稠度增高, 血管中脂肪栓塞就會(huì)誘發(fā)股骨頭血供障礙, 缺血壞死通常是最后結(jié)局［2］。

脂聯(lián)素是為一類機(jī)體中普遍存在的細(xì)胞因子, 其最大的特征體現(xiàn)在具備多樣化生物學(xué)功能方面上。對(duì)骨代謝效率產(chǎn)生影響的同時(shí), 有研究發(fā)現(xiàn), 在脂肪組織內(nèi)脂聯(lián)素與TNF-α存在互為拮抗的關(guān)系。脂聯(lián)素可促使TNF-α對(duì)NF-kB的活化效能降低, 進(jìn)而促使關(guān)節(jié)炎模型小鼠關(guān)節(jié)中炎性因子指標(biāo)降低, 阻斷炎性反應(yīng)對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整性的損傷過(guò)程［3-5］。

TNF-α不僅參與炎性反應(yīng)過(guò)程, 在骨質(zhì)吸收與再建過(guò)程發(fā)揮的作用也是不容忽視的, 其能夠?qū)A性磷酸酶的生物活性產(chǎn)生阻滯作用, 進(jìn)而影響骨形成效率［6-9］。有研究發(fā)現(xiàn), 高血壓鼠給予激素誘導(dǎo)后血漿TNF-α含量是激素給予前的1.5倍有余；也有報(bào)道顯示［10］, 激素性股骨頭缺血壞死者活組織內(nèi)可溶性TNF 的含量是創(chuàng)傷性股骨頭壞死活組織內(nèi)的3倍。

綜上所述, 脂聯(lián)素聯(lián)合辛伐他汀對(duì)VEGF 等細(xì)胞因子的分泌過(guò)程起到正向作用, 進(jìn)而提升股骨頭心血管與新骨生成效率, 能提高VEGF 陽(yáng)性成骨細(xì)胞率 , 從而修復(fù)骨壞死 , 有助于減輕患者疼痛感, 延緩缺血壞死癥狀發(fā)展過(guò)程。