基于楚雄腮扁葉蜂產(chǎn)卵行為的云南松針葉揮發(fā)性物質(zhì)分析

陳 敏, 劉方炎, 李永和(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；.西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，云南 昆明 6504)

楚雄腮扁葉蜂(Cephalciachuxiongica)隸屬膜翅目(Hymenoptera)扁葉蜂科(Pamphiliidae)腮扁葉蜂屬(Cephalcia)，是近年來(lái)云南省新發(fā)現(xiàn)的重大食葉害蟲(chóng)，主要危害云南松(Pinusyunnanensis)、華山松(Pinusarmandii)等松科植物的針葉[1].該蟲(chóng)自1984年首次報(bào)道以來(lái)，先后在云南省的20個(gè)縣市和四川會(huì)理陸續(xù)發(fā)生危害.起初危害面積不超過(guò)66.7 hm2，如今僅在云南省楚雄州境內(nèi)的危害面積就已達(dá)1 333 hm2以上，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2].其幼蟲(chóng)取食松樹(shù)針葉，吐絲形成灰白色幕巢，影響樹(shù)木正常生長(zhǎng)，造成樹(shù)木畸形，且為害后樹(shù)勢(shì)衰弱，易引發(fā)小蠹蟲(chóng)等次期性害蟲(chóng)的侵害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致寄主死亡，給防治帶來(lái)極大困難[3].

昆蟲(chóng)在其寄主植物上的產(chǎn)卵選擇性是其與寄主植物及其周邊環(huán)境長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，對(duì)其種群的生存繁衍具有重要的生物學(xué)意義[4].寄主植物的氣味是影響昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物選擇的一個(gè)重要因素[5].寄主植物能夠釋放出較高濃度的揮發(fā)物，雌蟲(chóng)通過(guò)嗅覺(jué)感受這些揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)尋找適合產(chǎn)卵的寄主植物及部位[6-8].松實(shí)小卷蛾(Retiniacria)雌蛾可在思茅松新鮮針葉上順利產(chǎn)卵，在衰弱針葉或沒(méi)有針葉的條件下則不產(chǎn)卵，新鮮針葉所含的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)其產(chǎn)卵有刺激作用[9].曾鑫年等[10]發(fā)現(xiàn)，寄主植物幼嫩葉中的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)對(duì)柑橘潛葉蛾(Phyllocnistiscitrella)成蟲(chóng)產(chǎn)卵有明顯的引導(dǎo)作用.目前，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)楚雄腮扁葉蜂雌蜂對(duì)云南松針葉粗提物有明顯的趨向反應(yīng)[11].但有關(guān)引誘楚雄腮扁葉蜂產(chǎn)卵的云南松針葉健康程度及其揮發(fā)性成分尚未見(jiàn)報(bào)道.本試驗(yàn)以云南省尋甸縣北大營(yíng)村采集的楚雄腮扁葉蜂為試驗(yàn)對(duì)象，室內(nèi)測(cè)定其在健康松針和衰弱松針不同部位的產(chǎn)卵量及其對(duì)松針不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的趨向率，并提取健康松針和衰弱松針不同部位的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行生物測(cè)定，試圖從化學(xué)生態(tài)學(xué)角度分析影響楚雄腮扁葉蜂產(chǎn)卵選擇性的因素，以期為防控楚雄腮扁葉蜂提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

楚雄腮扁葉蜂和健康、衰弱云南松均采自云南省尋甸縣北大營(yíng)村(N 25°18′、E 103°12′，海拔1 870 m)云南松林.健康松針和衰弱松針判斷標(biāo)準(zhǔn)：健康松針采自當(dāng)年生云南松，樹(shù)勢(shì)健壯，松針顏色翠綠，有光澤；衰弱松針采自當(dāng)年生云南松，樹(shù)勢(shì)衰弱，針尖發(fā)黃，顏色暗啞，無(wú)光澤.

1.2 楚雄腮扁葉蜂室內(nèi)產(chǎn)卵試驗(yàn)

在100 cm×100 cm×80 cm的養(yǎng)蟲(chóng)籠中進(jìn)行試驗(yàn)，養(yǎng)蟲(chóng)籠溫度為20～28 ℃，濕度(70±10)%.將長(zhǎng)約60 cm的健康云南松枝條和衰弱云南松枝條分別插入2個(gè)盛水的廣口瓶中，放入不同的養(yǎng)蟲(chóng)籠中央.每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠中放入羽化2 d的已交配的雌蜂5頭，24 h后統(tǒng)計(jì)松針尖端、中部和基部的產(chǎn)卵量.每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù).松針尖端、中部和基部的劃分標(biāo)準(zhǔn)：尖端取自距葉尖1.50 cm處，基部取自距根部1.50 cm處，其余為中部，長(zhǎng)7～10 cm.

1.3 云南松針葉揮發(fā)性物質(zhì)的提取

將松針按尖端、中部、基部截取為3段(劃分標(biāo)準(zhǔn)同1.2).分別提取健康松針和衰弱松針尖端、中部、基部的揮發(fā)性物質(zhì).每個(gè)部位設(shè)3個(gè)重復(fù).

松針揮發(fā)性物質(zhì)提取采用水蒸氣蒸餾萃取法[12].取健康松針和衰弱松針的尖端、中部、基部各100 g 剪碎后分別放到1 000 mL的蒸餾瓶中，加400 mL蒸餾水，水蒸氣蒸餾4 h.餾分用乙醚萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥24 h.提取的松針油用于“Y”型嗅覺(jué)儀生物測(cè)定和GC-MS分析.

1.4 “Y”型嗅覺(jué)儀生物測(cè)定

取羽化2 d已交配的雌蜂測(cè)試其對(duì)云南松針葉不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的行為反應(yīng)，生物測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11].將10頭試蟲(chóng)放入“Y”型嗅覺(jué)儀主管入口處，啟動(dòng)真空泵，5 min后檢查試蟲(chóng)的趨向行為.如果試蟲(chóng)進(jìn)入氣味源的支管，則記為正趨向；試蟲(chóng)進(jìn)入對(duì)照的支管，則記為負(fù)趨向；如果停留在主管中，則記為無(wú)選擇.

趨向率/%=(正趨向試蟲(chóng)數(shù)/總試蟲(chóng)數(shù))×100.

1.5 揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定

松針提取物分析測(cè)試在TRACE DSQ GC/MS聯(lián)用儀上進(jìn)行.

GC條件：色譜柱為DB-17(30.0 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫40 ℃(保留3 min)，40 ℃·min-1升溫到130 ℃，2 ℃·min-1升溫到160 ℃，20 ℃·min-1升溫到280 ℃，保持3 min.汽化室溫度230 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓5.08 psi，載氣流量1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL；分流比40∶1.

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 982 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z) 10～450.

1.6 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)物數(shù)據(jù)處理與分析通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成，利用色譜峰面積歸一法，測(cè)得各化學(xué)組分在揮發(fā)油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再經(jīng)GC-MS測(cè)定，運(yùn)用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)檢索、解析，確認(rèn)其化學(xué)成分.楚雄腮扁葉蜂平均產(chǎn)卵量及其對(duì)松針不同部位的趨向率，以及松針不同部位揮發(fā)性物質(zhì)含量的方差分析采用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)中單因素方差分析(one-way ANOVA)完成，并利用Duncan′s多重比較及t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.

2 結(jié)果與分析

表1 楚雄腮扁葉蜂雌蜂在松針不同部位的產(chǎn)卵量1)Table 1 Oviposition amount of female C.chuxiongica on different parts of pine needles

1)同列數(shù)值后附不同小寫(xiě)字母者表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05).

表2 楚雄腮扁葉蜂雌蜂對(duì)松針不同部位揮發(fā)物的趨向反應(yīng)1)Table 2 Taxis responses of female C.chuxiongica to volatile oil in different parts of pine needles

1)同列數(shù)值后附不同小寫(xiě)字母者表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05).

2.1 楚雄腮扁葉蜂雌蜂在松針不同部位的產(chǎn)卵量

由表1可知，楚雄腮扁葉蜂雌蜂在健康針葉和衰弱針葉不同部位的產(chǎn)卵量差異顯著(P<0.05).健康松針尖端、中部和基部的產(chǎn)卵量均顯著多于衰弱松針對(duì)應(yīng)部位的產(chǎn)卵量；在健康松針上，雌蜂在中部的產(chǎn)卵量最高，達(dá)(42.17±9.20)粒，顯著高于尖端和基部的產(chǎn)卵量.

2.2 楚雄腮扁葉蜂雌蜂對(duì)松針不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的趨向反應(yīng)

由表2可知，楚雄腮扁葉蜂雌蜂對(duì)健康松針中部揮發(fā)性物質(zhì)表現(xiàn)出明顯的趨向反應(yīng)，趨向率高達(dá)(68.33±10.20)%，顯著高于其對(duì)健康松針尖端和基部，以及衰弱松針各部位揮發(fā)性物質(zhì)的趨向率(P<0.05)；雌蜂對(duì)衰弱松針基部揮發(fā)性物質(zhì)的趨向率為0.由此表明，云南松健康針葉中段揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)楚雄腮扁葉蜂雌蜂具有很強(qiáng)的引誘作用.

2.3 健康松針和衰弱松針不同部位揮發(fā)物種類(lèi)及揮發(fā)量的差異

健康松針和衰弱松針不同部位共鑒定出27種揮發(fā)物(表3).由表3可見(jiàn)，健康松針和衰弱松針不同部位揮發(fā)物的種類(lèi)及揮發(fā)量存在差異.健康松針尖端共鑒定出14種揮發(fā)物，而衰弱松針尖端鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)為19種.其中，健康松針尖端β-蒎烯、石竹烯、雙丁噁唑、2-(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基-1-苯基乙基)苯酚、棕櫚酸、油酸的揮發(fā)量顯著高于衰弱松針，β-欖香烯、α-石竹烯、畢澄茄烯的揮發(fā)量顯著低于衰弱松針(P<0.05).健康松針中部檢測(cè)到的揮發(fā)物有15種，衰弱松針中部鑒定出了20種揮發(fā)性物質(zhì).其中，健康松針中部的β-蒎烯、石竹烯、β-杜松烯、雙丁噁唑、2-(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基-1-苯基乙基)苯酚、棕櫚酸的揮發(fā)量顯著高于衰弱松針，而畢澄茄烯的揮發(fā)量顯著低于衰弱松針(P<0.05).健康松針基部檢測(cè)到的揮發(fā)物種類(lèi)為16種，衰弱松針基部檢測(cè)到的揮發(fā)物種類(lèi)為12種.其中，健康松針基部β-蒎烯、乙酸異龍腦酯、β-欖香烯、石竹烯、α-石竹烯的揮發(fā)量顯著高于衰弱松針，而畢澄茄烯、2-(1,1-二甲基乙基)-4-(1-甲基-1-苯基乙基)苯酚的揮發(fā)量顯著低于衰弱松針(P<0.05).

由表3還可見(jiàn)，與衰弱松針相比，健康松針不同部位釋放的揮發(fā)性物質(zhì)，除揮發(fā)量發(fā)生顯著變化外，還產(chǎn)生特異性揮發(fā)物：在健康松針尖端檢測(cè)到乙酸異龍腦酯、杜松烯、鄰苯二甲酸二異辛酯等衰弱松針尖端沒(méi)有的特異性組分；中部檢測(cè)到3-蒈烯、乙酸異龍腦酯、杜松烯、對(duì)苯二甲酸二(2-乙基己)酯等；基部檢測(cè)到α-蒎烯、杜松烯、雙丁噁唑、金合歡醇、棕櫚酸、油酸等.在衰弱松針尖端和中部也檢測(cè)到α-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯、1-乙烯基-1-甲基-4-丙-2-亞基-2-丙-1-烯-2-基環(huán)己烷、衣蘭烯、惹烯等特異性組分；在衰弱松針基部檢測(cè)到β-杜松烯、卡達(dá)烯、間苯二甲酸二(2-乙基己基)酯等健康松針基部所沒(méi)有的組分.

3 討論

在植食性昆蟲(chóng)的生命周期中，產(chǎn)卵是其繁衍后代、維持種群數(shù)量的重要環(huán)節(jié).一般認(rèn)為，親代雌成蟲(chóng)的產(chǎn)卵具有選擇性，其產(chǎn)卵場(chǎng)所有利于后代個(gè)體的存活和生長(zhǎng)發(fā)育[13].曾鑫年等[10]觀察發(fā)現(xiàn)，柑橘潛葉蛾選擇在嫩葉上產(chǎn)卵，在蕉柑上選擇產(chǎn)卵的葉片長(zhǎng)度為1～3.3 cm，橙類(lèi)的葉片長(zhǎng)度為1～4.5 cm，在超過(guò)以上長(zhǎng)度的嫩葉上極少產(chǎn)卵.刺桐姬小蜂(Quadrastichuserythrinae)雌蜂最喜歡產(chǎn)卵于長(zhǎng)1～2 cm的未展開(kāi)或半展開(kāi)的刺桐幼嫩葉片上，當(dāng)新梢葉片大于3.5 cm時(shí)不產(chǎn)卵[14].本研究發(fā)現(xiàn)，楚雄腮扁葉蜂雌蜂選擇在健康松針上產(chǎn)卵，且在健康松針中部的產(chǎn)卵量最高.通過(guò)“Y”型嗅覺(jué)儀的生物測(cè)定，進(jìn)一步確定楚雄腮扁葉蜂雌蜂對(duì)健康松針尤其是健康松針中部揮發(fā)性物質(zhì)表現(xiàn)出明顯的趨向反應(yīng).生物測(cè)定結(jié)果與室內(nèi)產(chǎn)卵試驗(yàn)結(jié)果一致.

表3 云南松健康針葉和衰弱針葉不同部位揮發(fā)性物質(zhì)含量1)Table 3 Content of volatile substance released from different parts of pine needles of health and weak P.yunnanensis

1)不同小寫(xiě)字母表示松針不同部位的同種揮發(fā)物含量差異顯著(P<0.05)；*表示同種揮發(fā)物含量在健康松針、衰弱松針之間差異顯著(P<0.05).

寄主植物揮發(fā)性物質(zhì)在雌成蟲(chóng)產(chǎn)卵定位過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[15].已有研究表明，寄主植物歐洲赤松中的β-蒎烯、檸檬烯和月桂烯是決定歐洲赤松葉蜂(Diprionpini)雌蜂產(chǎn)卵的主要因素[16].對(duì)歐洲新松葉蜂(Neodiprionsirtifer)雌蜂產(chǎn)卵研究發(fā)現(xiàn)，檸檬烯濃度較高，對(duì)歐洲新松葉蜂雌蜂產(chǎn)卵具有驅(qū)避作用，但濃度較低時(shí)則具有引誘作用[17].對(duì)松實(shí)小卷蛾雌蛾產(chǎn)卵研究發(fā)現(xiàn)，健康思茅松針葉和衰弱針葉揮發(fā)物含量和種類(lèi)存在差異，松實(shí)小卷蛾只在具備健康思茅松針葉的條件下才產(chǎn)卵[9].本研究發(fā)現(xiàn)，云南松健康松針不同部位揮發(fā)性物質(zhì)含量存在顯著差異.健康松針中部的揮發(fā)性物質(zhì)β-蒎烯和雙丁噁唑含量顯著高于尖端和基部，杜松烯則明顯低于尖端和基部.這可能是造成雌蜂在健康松針中部有較高的產(chǎn)卵量并對(duì)中部揮發(fā)物有較高趨向率的一個(gè)重要原因.另外，與衰弱松針中部相比，健康松針中部存在3-蒈烯、乙酸異龍腦酯、杜松烯、對(duì)苯二甲酸二(2-乙基己)酯等特異性揮發(fā)物.這可能是造成雌蜂在衰弱松針中部的產(chǎn)卵量和對(duì)其揮發(fā)物趨向率顯著低于健康松針中部的原因之一.但究竟是哪種揮發(fā)物在楚雄腮扁葉蜂產(chǎn)卵選擇上起主要作用，以及如何利用云南松健康針葉和衰弱針葉揮發(fā)性物質(zhì)的差異來(lái)控制楚雄腮扁葉蜂的產(chǎn)卵和危害，有待進(jìn)一步研究.