植物精油在魚類養(yǎng)殖中的研究與應用

崔惠敬，孟玉霞，趙前程,2，呂 可，邊楚涵，馬永生

( 1.大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.新興際華伊犁農牧科技發(fā)展有限公司，新疆 伊寧 835000 )

自20世紀90年代開始，中國水產養(yǎng)殖一直位于世界主導地位。2015年我國水產品總產量達6.699×107t，其中養(yǎng)殖產量為4.937×107t，占總產量的73.7%，也是世界上唯一養(yǎng)殖產量超過捕撈量的國家[1]。然而，隨著規(guī)?；图s化養(yǎng)殖水平的提高，水產動物病害問題日趨嚴重。我國平均每年因水產養(yǎng)殖病害造成的損失達百億元，其中魚類約占55%～77%、貝類約占3%～16%、甲殼類約占11%～28%[2]。

目前水產動物病害防治主要依賴抗生素、抗寄生蟲藥及消毒劑等化學藥物，常引起細菌耐藥性、環(huán)境污染及水產品中藥物殘留等問題。免疫防治雖是水產動物疾病控制的有效途徑，但我國漁用疫苗研發(fā)及應用相對滯后，目前只有4個水產動物疫苗獲國家新獸藥證書，其中僅珠江水產研究所研發(fā)的草魚出血病活疫苗和嗜水氣單胞菌滅活疫苗分別于2011年和2012年被批準生產使用，可用商品化漁用疫苗數(shù)量極其有限，遠不能滿足水產動物疫病防治的需求。因此，水產養(yǎng)殖中亟需安全高效、天然無殘留的飼用抗生素替代品。至今報道具有潛在應用前景的水產用抗生素替代品有中草藥[3]、噬菌體[4]、卵黃免疫球蛋白[5]和植物精油[6]等。

植物精油又稱揮發(fā)油，廣泛存在于芳香植物中，現(xiàn)已知的植物精油超過3000種，其中約有300余種已廣泛應用于食品、制藥和香料等行業(yè)[7]。近來鑒于植物精油的高效抗菌作用，因此其被視為潛在的飼用抗生素替代品，尤其在畜禽和反芻動物中研究較多，如肉桂醛和丁香酚可有效減少腸炎沙門氏菌(Salmonellaenterica)在肉雞盲腸中的定殖[8]；薄荷(Menthaarvensis)精油能提高斷奶仔豬回腸蛋白質和氨基酸消化率，從而顯著改善飼料效率[9]；牛至(Origanumvulgare)精油可控制由金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)引起的奶牛乳房炎[10]等，Zeng等[11-13]也綜述了關于植物精油在畜禽和反芻動物生產中應用。近來研究發(fā)現(xiàn)植物精油同樣能有效防治水產動物細菌性疾病、水霉病和寄生蟲病，且能增強魚非特異性免疫力，提高魚類生產性能，并在尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[14-15]、蟾胡子鲇(Clariasbatrachus)[16]、金魚(Carassiusauratus)[17]等養(yǎng)殖中取得了顯著成效。筆者綜述了植物精油作為抗菌劑、殺蟲劑、免疫增強劑及生長促進劑在魚類養(yǎng)殖中的研究進展，旨在為水產動物生態(tài)健康養(yǎng)殖提供參考。

1 植物精油應用于魚類病害的防治

1.1 精油對養(yǎng)殖魚類細菌性疾病的防治

細菌是水產動物病害的主要病原，占生物源性疾病的57.6%[2]。常見致病菌包括弧菌屬(Vibrio)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和鏈球菌屬(Streptococcus)等。細菌性疾病的防治仍主要依賴抗生素和人工合成抗菌藥，目前我國水產用抗生素共有3類4個品種，分別為氨基糖苷類的硫酸新霉素粉、四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素、酰胺類的氟苯尼考和甲砜霉素；另含磺胺類和喹諾酮類兩大人工合成類抗菌藥物，共11個品種[18]。但農業(yè)部2292號公告決定自2016年12月31日起，停止在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星4種喹諾酮類抗菌藥[19]，這也給水產動物病害防控帶來挑戰(zhàn)，迫切需要研發(fā)新型抗生素替代品來防治水產養(yǎng)殖動物細菌性疾病。

現(xiàn)已證實，植物精油具有抗水產動物致病菌活性。Lee等[20]發(fā)現(xiàn)，丁香(Syzygiumaromaticum)精油對海魚弧菌(V.damsela)、遲鈍愛德華氏菌(E.tarda)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的最低抑菌質量濃度為0.015～0.062 μg/mL，但該研究未通過體內試驗驗證。Thomas等[16]將印度苦楝油制備成納米乳劑，其體外抗菌活性與環(huán)丙沙星相當；對蟾胡子鲇進行肌肉注射，可有效防治由殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)引起的潰瘍性病變，治療組魚存活率可由50%提高至90%。

精油理想的給藥方式是藥浴或通過混飼口服。Rattanachaikunsopon等[14]研究顯示，丁香精油對格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)的最低抑菌質量濃度為30 μg/mL，飼料中添加3%丁香精油使經格氏乳球菌攻毒感染后的尼羅羅非魚的累積死亡率由50%降至0%。與此類似，肉桂(Cinnamomumverum)精油對海豚鏈球菌(S.iniae)的最低抑菌質量濃度為40 μg/mL，飼料中添加0.4%肉桂精油，使經海豚鏈球菌攻毒感染的尼羅羅非魚累積死亡率降低50%[15]?；祜暱诜偷膯栴}是，魚被致病菌感染發(fā)病后，一般攝食下降或停止，此時經口給藥就難以實施；此外，某些精油的味道也可能影響魚的攝食。

上述研究均為淡水養(yǎng)殖魚類，海水養(yǎng)殖魚類尚鮮見報道。筆者所在實驗室首次研究了植物精油或其組分對養(yǎng)殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)關鍵致病菌遲緩愛德華氏菌和大菱鲆弧菌的體外和體內抗菌活性，結果顯示，肉桂醛、丁香酚、百里香酚、檸檬草、山蒼子及檸檬醛對遲鈍愛德華氏菌和大菱鲆弧菌分離株均有強烈抑制作用，最低抑菌含量為0.25～1 μL/mL[24]；給大菱鲆腹腔注射大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)攻毒，后經200 μL/L山蒼子精油(Litseacubeba)浸浴處理，結果顯示，精油治療組死亡率由對照組50%降至0%[25]，防治效果較為顯著。

1.2 植物精油對養(yǎng)殖魚類水霉病的防治

水霉是卵菌綱、水霉目下類真菌微生物的統(tǒng)稱[26]，廣泛分布于各淡水水域，其中對養(yǎng)殖魚類危害較大主要是水霉科下的3個屬，分別為水霉屬(Saprolegnia)、綿霉屬(Achlya)和絲囊霉屬(Aphanomyces)[27]，淡水養(yǎng)殖中尤以寄生水霉(S.parasitica)、澳大利亞水霉(S.australis)和異枝水霉(S.diclina)最為常見。水霉易感染魚卵以及體表有傷的魚苗和成魚，是困擾虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Salmosalar)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)等養(yǎng)殖魚類的主要病原之一。三苯甲烷類染料孔雀石綠曾被用作水霉病防治的有效化學藥物，但鑒于其致癌、致畸和致突變性，早在2002年我國農業(yè)部就將其列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》。曾用過氧化氫[28]、臭氧[29]、甲醛[30]和高含量氯化鈉(1%～3%)[31]等替代孔雀石綠，但安全性和治療有效性均難以達到水產養(yǎng)殖需求。因此，采用安全高效的替代藥物防治水霉病，是水產養(yǎng)殖及水產品質量安全領域需迫切解決的問題，而植物精油不失為一種潛在選擇。

諸多研究已證實，植物精油能有效抑制黃曲霉、赫曲霉和寄生曲霉等食品中常見真菌，并控制真菌毒素產生[32]。與此相似，最近有學者嘗試將精油用于控制水霉。體外試驗中Adel等[33]發(fā)現(xiàn)刺芹(Eryngiumcampestre)和大蒜(Alliumsativum)精油對寄生水霉具有較強抑制效果，最低殺菌質量濃度分別為0.5 μg/mL和0.12 μg/mL。林崗等[34]研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油能損傷分離自鰻鱺(Anguillajaponica)同絲水霉(S.monoica)卵孢子和菌絲細胞壁及細胞膜，抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長。

魚卵胚胎發(fā)育早期易感染水霉，一般寄生于死卵上的水霉易傳染至活卵，嚴重影響孵化率。Khosravi等[35]研究發(fā)現(xiàn)波斯蘇(Zatariamultiflora)精油對寄生水霉的最低抑菌質量濃度為0.9 μL/L；將被水霉感染的虹鱒魚卵在含10 μL/L波斯蘇精油的水中浸浴60 min，日處理3次，魚卵平均孵化率由1%提高至11%。但精油在水中溶解度低，難以發(fā)揮有效抗菌活性，故該研究中精油抗水霉活性仍低于孔雀石綠。值得注意的是，波斯蘇精油的主要成分是百里香酚和香芹酚，推測一些與此主要成分相似的精油，如牛至油也應具有類似抗水霉活性，這值得進一步研究。

Madrid等[36]發(fā)現(xiàn)，智利香皮茶(Laureliopsisphilippiana)樹皮精油與樹葉精油對從大西洋鮭分離得到的水霉抑制效果顯著，其最低抑菌質量濃度分別為30 μg/mL和100 μg/mL，最低殺菌質量濃度分別為50 μg/mL和125 μg/mL?？梢?，同種植物不同組織中精油組分及其含量存在差異，故顯示不同的抗菌活性。

1.3 植物精油對養(yǎng)殖魚類寄生蟲病的防治

寄生蟲病是魚類養(yǎng)殖中的主要病害之一，據(jù)全國水產技術推廣總站提供的數(shù)據(jù)，2010年，全國30個省99種水產養(yǎng)殖對象中共發(fā)生了94種疾病，其中寄生蟲病占了24種[37]。魚類寄生蟲種類繁多，分類學上主要包括原生動物門、扁形動物門、線形動物門、棘頭動物門及節(jié)肢動物門，其中扁形動物、線形動物和棘頭動物習慣上被統(tǒng)稱為寄生蠕蟲。寄生蟲對魚體危害包括造成魚組織機械損傷、掠奪宿主營養(yǎng)、壓擠宿主組織器官及釋放毒素等，最終導致宿主魚生長緩慢，甚至死亡[38]。我國現(xiàn)行漁用驅殺蟲藥物包括內服藥和外用藥兩大類，其中內服藥有鹽酸氯苯胍、阿苯達唑及吡喹酮等，外用藥包括硫酸鋅、敵百蟲、高效氯氰菊酯等[39]。但這些化學驅蟲藥不可避免帶來水產品藥物殘留及水體環(huán)境污染等問題。因此，在綠色健康水產養(yǎng)殖模式的發(fā)展趨勢和要求下，迫切需要尋求一種安全有效的新型驅殺蟲藥物。

車輪蟲(Trichodina)是一大類寄生性纖毛蟲原生動物，廣泛寄生于淡海水魚、貝及甲殼類的鰓、皮膚等部位，可導致宿主嚴重的組織病變。印楝油提取于楝科植物印楝(Azadirachtaindica)，其主要活性組分為萜類化合物印楝素。吳偉等[40]研究發(fā)現(xiàn)，印楝素具有較強的細胞滲透性，對車輪蟲有良好的殺滅效果。將感染寄生蟲的鯉魚(Cyprinuscarpio)浸入含0.2～0.8 mg/L印楝素的水體中，3 d后發(fā)現(xiàn)鯉魚鰓上的車輪蟲數(shù)量分別減少40%～92%，驅殺效果與使用劑量呈正相關。同樣的，Kumar等[17]使用20 mg/L的印楝素處理鲺(Argulus)，體外試驗發(fā)現(xiàn)2.5 h后，所有寄生蟲均死亡；體內試驗發(fā)現(xiàn)，相同質量濃度印楝素浸浴感染鲺的金魚，48 h寄生蟲完全死亡。

單殖吸蟲屬扁型動物門吸蟲綱，可寄生在多種水生生物上，以魚類最常見。Boijink等[41]將大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)稚魚在質量濃度為10、15 mg/L的丁香羅勒(Ocimumgratissimum)精油中浸浴15 min，7 d后鰓上的單殖吸蟲數(shù)量分別減少了94%和100%。

2 植物精油對養(yǎng)殖魚類免疫功能的影響

免疫增強劑又稱免疫刺激劑，能提高機體非特異性或特異性免疫功能，增強機體抗疾病感染能力。魚類免疫增強劑主要通過增強非特異性免疫應答而發(fā)揮作用，如促進溶菌酶、天然溶血素、補體、巨噬細胞活化因子及干擾素等的合成，或增強巨噬細胞、嗜中性粒細胞等吞噬活性[42]。目前，黃芪多糖、β-葡聚糖等植物源免疫增強劑已被成功應用于水產養(yǎng)殖動物病害防治，植物精油也是其中一種潛在的水產動物免疫增強劑[43]。

鏈球菌是危害養(yǎng)殖羅非魚的關鍵病原，臨床分離株主要有海豚鏈球菌和無乳鏈球菌(S.agalactiae)兩種，前者在短時間內造成羅非魚很高致死率(>50%)。Acar等[44]向羅非魚日糧中分別添加0.1%、0.3%或0.5%甜橙精油，連續(xù)飼喂90 d后，魚血清溶菌酶、過氧化物酶活性和吞噬細胞活性顯著提高；且羅非魚經海豚鏈球菌攻毒感染后的存活率由13.3%提高至58.3%。Awad等[45]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加3%黑枯茗(Nigellasativa)精油顯著提高了虹鱒魚血液中溶菌酶活性、吞噬細胞及免疫球蛋白活性。Soltani等[46]在鯉魚飼料中添加30、60 mg/kg的波斯蘇精油，連續(xù)飼喂8 d，后發(fā)現(xiàn)鯉魚血清殺菌活性、白細胞數(shù)均顯著增加，但對鯉魚血清溶菌酶活性無影響。波斯蘇精油的主要組分為百里香酚、香芹酚和對傘花烴，因此，未來很有必要考察每種精油單體組分對魚的免疫調節(jié)作用。

也有研究直接使用芳香植物的葉子作為飼料添加劑。Nguyen等[47]在飼料中添加2%～8%山蒼子葉粉末，連續(xù)飼喂21 d后，鯉魚血液中溶菌酶活性、溶血素及吞噬細胞等非特異性免疫指標顯著升高。值得注意的是，該研究中山蒼子葉精油的主

表1 植物精油在控制水產動物病害中的應用及效果

注：a表示未給出水霉的具體種別.

要組分為芳樟醇(94.9%)，而我國西南地區(qū)山蒼子果實中的精油主要為檸檬醛，存在明顯區(qū)別。這也提示不同化學型的植物原料中精油組分存在較大差異，這也給精油生物活性研究的橫向比較帶來了困難。

目前，植物精油對魚類免疫調節(jié)的確切機制尚不清楚，但可以從魚類腸道菌群調節(jié)角度予以部分解釋。以陸生動物為例，Li等[48]研究證實，百里香酚和肉桂醛混合精油能減少仔豬糞中大腸桿菌數(shù)量，并增加乳酸桿菌的數(shù)量；Mitsch等[49]研究證實，精油能減少產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)在肉雞腸道中的定殖。鑒于腸道微生物在魚類免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮重要作用，并且腸道菌群可通過特定代謝產物調節(jié)宿主的免疫反應[50]，據(jù)此推測，植物精油的免疫調節(jié)活性可能與其腸道菌群調節(jié)作用相關。不過，Navarrete等[51]曾用溫度梯度凝膠電泳方法研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加20 mg/kg百里香精油對虹鱒腸道微生物組成并無顯著影響，其原因可能與精油的選擇或虹鱒腸道微生物的特征組成有關?？梢姡蛯︳~類腸道菌群及免疫機能的調節(jié)作用還需要在其他魚種中嘗試更多不同的精油進行驗證。

3 植物精油對養(yǎng)殖魚類生長性能的影響

動物養(yǎng)殖業(yè)中常在動物飼料中使用抗生素類生長促進劑，但基于動物性食品質量安全和公共衛(wèi)生安全的考慮，目前已被逐漸禁用，如歐盟與韓國已相繼于2006年1月和2011年7月起全面禁止抗生素類促生長劑。植物精油作為飼用抗生素替代品已廣泛用于動物飼料中，其中牛至精油已被列入我國飼料藥物添加劑附錄一目錄中，可在飼料中長時間添加使用[52]，具體產品如“諾必達”、“好力高”等。但這些產品主要用于陸生動物養(yǎng)殖中，以預防動物疾病，促進動物生長。

與此類似，Acar等[44]在飼料中添加0.1%甜橙精油，連續(xù)飼喂12周，與對照組相比，甜橙精油使羅非魚質量增加率提高21%，飼料系數(shù)由1.69降至1.31。值得注意的是，在此項研究中，當將精油添加劑量提至0.3%或0.5%時，促生長功效卻顯著下降，這提示在應用精油時需要優(yōu)化添加劑量。

提取后的精油易揮發(fā)并發(fā)生氧化，貯藏穩(wěn)定性差，故也有研究直接使用含精油的植物組織粉末作為添加劑，Nguyen等[47]在鯉魚飼料中添加8%山蒼子葉粉末，飼喂21 d，魚體質量增加量提高88.2%，特定生長速率由0.56%升至0.99%，飼料系數(shù)由4.70降至2.48，也取得了理想的促生長效果。

目前關于植物精油促進魚類生長的機理研究尚鮮見報道，不過一些在畜禽中的研究結果可能會給我們提供一些參考。目前已知，植物精油可通過提高腸道胰蛋白酶和淀粉酶活性[53]，促進小腸絨毛生長，增加小腸隱窩深度[54]以及調節(jié)腸道菌群而發(fā)揮促生長作用[48]，但這些機制是否適用于魚類還有待進一步研究。

4 結論與展望

植物精油具有高效抗菌和天然安全的優(yōu)勢，是一種極具潛力的飼用抗生素替代品，且兼具驅殺蟲和免疫增強的功效。將植物精油應用于水產養(yǎng)殖中，有望實現(xiàn)水產動物養(yǎng)殖過程中“免抗生素防病”的目的，也為從源頭解決養(yǎng)殖水產品存在的藥物殘留問題提供了新途徑。

植物精油作為水產飼料添加劑尚存在諸多需要解決的問題：(1)植物精油成分十分復雜，包括幾十種含量不同的化合物，各組分間又可能存在交互作用，具體作用機制難以完全闡明；(2)植物精油組分均為脂溶性小分子，透皮吸收，不同給藥方式下精油在水產動物體內的吸收、分布、代謝及排泄等藥代動力學規(guī)律尚需進一步研究；(3)目前植物精油對養(yǎng)殖魚類的毒性和毒理數(shù)據(jù)缺乏，未來需要通過大量的動物體內試驗來研究精油對特定水產養(yǎng)殖動物的急、慢性毒性，為選擇及安全使用精油提供參考。