13-甲基十四烷酸對(duì)大鼠局灶性缺血腦組織的保護(hù)作用

何宏星， 翁繩美， 胡 瀟， 余 涓

13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoicacid, 13-MTD)，也稱為13-甲基肉豆蔻酸，是一種末端支鏈的中長鏈飽和脂肪酸，可從大豆發(fā)酵產(chǎn)物中提取，也可人工合成，天然存在于細(xì)菌和某些真菌的細(xì)胞膜上，是細(xì)菌胞膜的重要成分，可通過調(diào)節(jié)膜的組成而影響細(xì)胞的功能[1]。Faung等發(fā)現(xiàn)，13-MTD可有效抑制某些細(xì)菌感染導(dǎo)致的出血及血小板聚集引起的有關(guān)疾病[2]。本課題組既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，13-MTD可明顯縮小腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)后腦梗死的體積，改善神經(jīng)功能缺損程度，減輕腦水腫，保護(hù)血腦屏障(blood brain barrier, BBB)的結(jié)構(gòu)和功能，其機(jī)制與13-MTD的穩(wěn)膜、抗炎、抗氧化、抑制環(huán)氧化酶(cycloxygenase-2, COX-2)/5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)等作用均有關(guān)[3-5]。在此基礎(chǔ)上，本研究主要探討13-MTD對(duì)大鼠不同持續(xù)時(shí)間腦缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷以及腦水腫的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品與試劑 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠75只，體質(zhì)量230～270 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(閩)2012-0001]。13-MTD系福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成(純度99.8%)，以脂質(zhì)體包裹(含量10 mg/mL)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)分析純(上?；瘜W(xué)試劑公司)，磷酸鹽緩沖液配制，避光低溫貯存；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 75只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、溶媒對(duì)照(Vehicle)組及13-MTD 40(M40)，80(M80)，120 mg/kg(M120)干預(yù)組；每組又按腦缺血時(shí)間分為6，12，24 h組，共15組，每組5只。13-MTD各劑量組插入線栓前30 min，分別于尾靜脈注射13-MTD 40，80及120 mg/kg；假手術(shù)組不插入線栓；溶媒對(duì)照組則給予等體積空白脂質(zhì)體。各組大鼠均于相應(yīng)缺血時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，評(píng)分后根據(jù)需要處死取樣。

1.2.2模型制備 線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)[6]。動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔麻醉，頸部正中切口，鈍性分離頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈。在距離頸總動(dòng)脈分叉約1 cm處結(jié)扎近心端，電凝遠(yuǎn)心端。用無創(chuàng)小動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，在頸外動(dòng)脈殘端距頸總動(dòng)脈分支約3 mm處剪一小口，將線栓自頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，打開頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾將線栓向前推進(jìn)(18.5±0.5)mm(自分叉處計(jì))，結(jié)扎固定線栓，松開頸總動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾，縫合切口。MCAO模型成功的標(biāo)志為動(dòng)物清醒后出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱和行走時(shí)的追尾癥。

1.2.3神經(jīng)功能缺失評(píng)分 參照Longa建立的神經(jīng)功能缺失評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，判斷模型是否成功[7]。0分：無明顯神經(jīng)缺損癥狀，活動(dòng)正常；1分：垂直提起時(shí)不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢(輕度局灶性神經(jīng)功能缺損)；2分：行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度局灶性神經(jīng)功能缺損)；3分：行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒(重度局灶性神經(jīng)功能缺損)；4分：不能自發(fā)行走或有意識(shí)障礙。1～3分者為手術(shù)成功的標(biāo)志，棄去手術(shù)中出血過多的動(dòng)物。

1.2.4腦梗死體積與腦水腫程度測定 參照文獻(xiàn)[8]的方法，于相應(yīng)的缺血時(shí)間迅速斷頭取腦，將腦組織置于生理鹽水冰盤上行冠狀切片，切4刀成5片。迅速將腦片置2%的TTC中避光染色，37 ℃溫孵30 min，將腦片置10%福爾馬林中避光保存過夜。將固定后的染色結(jié)果拍照輸入計(jì)算機(jī)，利用AutoCAD圖像處理軟件，計(jì)算出梗死區(qū)域(白色)占大腦總體積的百分比作為梗死灶體積，并用同樣的方法計(jì)算出缺血側(cè)腦水腫程度：

腦水腫(%)=(缺血側(cè)腦半球體積-非缺血側(cè)腦半球體積)/非缺血側(cè)腦半球體積×100%

1.2.5腦干濕重測定腦含水量 于相應(yīng)缺血時(shí)間處死大鼠，迅速取出腦組織，切成等厚度的5片，準(zhǔn)確稱量濕重后，將腦片放入烤箱內(nèi)于110 ℃烤24 h，至恒重后，取出稱量腦片干重。

腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%

1.2.6BBB通透性檢測 按Belayev法以EB作為示蹤劑，檢測BBB的損傷程度[9]。動(dòng)物處死前2 h，尾靜脈注射2%的EB 2 mL/kg，大鼠眼球結(jié)膜、四肢等處顯示藍(lán)色，表示注入成功。用1%肝素生理鹽水經(jīng)左心室灌流，然后迅速取損傷側(cè)腦組織，稱取濕重后置入裝有3 mL甲酰胺的勻漿器，54 ℃水浴孵育24 h，讓組織中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中。將溶有EB的甲酰胺溶液過濾，用酶標(biāo)儀(λ=630 nm)測定各組的光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出EB含量，依據(jù)所測得的濃度計(jì)算出BBB對(duì)EB的通透率，以每克濕重腦組織內(nèi)所含EB的量(μg/g)表示。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能缺失評(píng)分 各組大鼠于腦缺血6，12及24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較。假手術(shù)組為0分。溶媒對(duì)照組于缺血6，12，24 h均有不同程度的神經(jīng)功能缺失癥狀，表現(xiàn)為右側(cè)眼瞼下垂，提尾懸空時(shí)，左前肢內(nèi)收及軀干向左側(cè)扭轉(zhuǎn)，運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈式行走為追尾征，神經(jīng)功能缺失嚴(yán)重時(shí)向左側(cè)傾倒，各缺血時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與溶媒對(duì)照組比較，13-MTD各劑量組于各缺血時(shí)段的神經(jīng)功能缺失評(píng)分均降低(均低于1分)，無明顯神經(jīng)缺損癥狀，活動(dòng)較為正常；在6 h時(shí)段，神經(jīng)功能缺失評(píng)分較低，且在80 mg/kg以下存在劑量依賴性，以M80組改善最為明顯，M120組未表現(xiàn)更好的效果(P<0.01，圖1)。

n=5. 13-MTD：13-甲基十四烷酸； MCAO：大腦中動(dòng)脈閉塞. 與溶媒對(duì)照組比較，☆：P<0.01；13-MTD各劑量組兩兩比較，△：P<0.01.圖1 13-MTD對(duì)MCAO大鼠不同缺血時(shí)間神經(jīng)功能的影響Fig 1 Effect of 13-MTD on neurological deficit score in different groups after 6 h,12 h and 24 h MCAO in rats

2.2腦梗死面積 經(jīng)2%的TTC染色，假手術(shù)組各缺血時(shí)間點(diǎn)的腦片全紅，色澤均勻，表明無損傷；溶媒對(duì)照組中，6 h組缺血側(cè)腦組織皮層部分有白色梗死灶，12 h組白色梗死灶明顯，累及整個(gè)缺血側(cè)的大腦皮層，24 h組白色梗死灶最為明顯，累及整個(gè)缺血側(cè)腦半球，并伴有輕度糜爛；13-MTD各劑量組缺血側(cè)腦組織外觀均有所改善，白色梗死灶范圍均有所減少(P<0.01)，尤其以M80組治療效果最好(P<0.05)，各劑量組腦梗死面積比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)，以缺血6 h的腦梗死面積比例最低，而缺血12和24 h的白色梗死灶出現(xiàn)一定程度的減少，但效果不如6 h組。

2.3腦組織水腫程度 腦缺血6，12及24 h后，損傷側(cè)腦水腫程度明顯強(qiáng)于對(duì)側(cè)，腦體積增大且含水量增加，至24 h時(shí)損傷最重。各缺血時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組大腦體積均勻；溶媒對(duì)照組兩側(cè)腦組織體積不均等，缺血側(cè)腦組織體積稍大，水腫明顯(P<0.01)；與溶媒對(duì)照組比較，13-MTD各劑量組腦組織水腫減輕(P<0.01)，以M80組效果最好(P<0.01)，各劑量組之間差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。

2.4腦含水量 與假手術(shù)組比較，溶媒對(duì)照組各缺血時(shí)間點(diǎn)的腦組織含水量均明顯增加(P<0.01)，以24 h組最嚴(yán)重(P<0.001)；與各時(shí)間點(diǎn)溶媒對(duì)照組比較，各劑量13-MTD組腦組織含水量均明顯下降(P<0.05)，以M80組效果最好(P<0.01，圖3B)；在6 h時(shí)，腦組織含水量下降較為明顯，12和24 h的腦組織含水量雖有所下降，但與6 h比較并不是很理想。

n=5. A：缺血6 h; B:缺血12 h; C:缺血24 h； D：不同缺血時(shí)間的腦梗死面積比例. 1：假手術(shù)組； 2：溶媒對(duì)照組； 3～5：M40, M80, M120組. 與溶媒對(duì)照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01；與M80組比較，△：P<0.05，△△：P<0.01.圖2 13-MTD對(duì)MCAO大鼠不同缺血時(shí)間腦梗死面積的影響Fig 2 Comparison effect of 13-MTD on infarct size in different groups after MCAO 6 h, 12 h and 24 h in rats

n=5. A:腦組織水腫程度； B：腦含水量. 與溶媒對(duì)照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01；與M80組比較，△△：P<0.01.圖3 13-MTD對(duì)MCAO大鼠不同缺血時(shí)間腦組織水腫程度及腦含水量的影響Fig 3 Effect of 13-MTD on cerebral edema， dry and wet weight in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6 h, 12 h and 24 h in rats

2.5BBB通透性的改變 在腦缺血6，12及24 h后，肉眼可見腦組織有藍(lán)色物質(zhì)滲出，并隨時(shí)間推移藍(lán)色區(qū)域擴(kuò)大，提示腦缺血后BBB損傷，有EB滲出，至缺血24 h時(shí)藍(lán)色區(qū)域最大。各缺血時(shí)間段，假手術(shù)組腦片肉眼基本看不見藍(lán)色滲出；與假手術(shù)組比較，溶媒對(duì)照組于各缺血時(shí)間點(diǎn)均可見明顯的藍(lán)色區(qū)域(P<0.01)；與溶媒對(duì)照組比較，13-MTD各劑量組腦組織EB滲出明顯減少(P<0.05)，以M80組效果最好(圖4)。

3 討 論

腦缺血中風(fēng)在腦血管疾病中以其高死亡率和嚴(yán)重臨床癥狀為特點(diǎn)，缺血后腦水腫的形成使神經(jīng)功能損傷加速惡化，顱內(nèi)壓升高，腦血流量減少，最終導(dǎo)致腦疝和患者死亡[10]。本研究采用提前30 min預(yù)給藥，證明13-MTD可改善大鼠MCAO的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，縮小腦梗死體積，減輕腦水腫。本課題組以往研究證明，13-MTD對(duì)CIRI有緩解作用，本研究顯示，13-MTD對(duì)持續(xù)長時(shí)間缺血腦組織的功能也有保護(hù)作用。

n=5. A：缺血6 h; B:缺血12 h; C:缺血24 h； D：不同缺血時(shí)間的腦組織EB含量. 1：假手術(shù)組； 2：溶媒對(duì)照組； 3～5：M40, M80, M120組. 與溶媒對(duì)照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01；與M80組比較，△△：P<0.01.圖4 不同缺血時(shí)間13-MTD對(duì)不同干預(yù)組EB含量的影響Fig 4 Effect of 13-MTD on the content of EB after MCAO 6 h, 12 h and 24 h in rats

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的線栓法阻斷大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery, MCA)的血供來制作腦缺血模型。MCA主要供應(yīng)顳葉、頂葉及基底節(jié)等處的血液，涉及調(diào)控運(yùn)動(dòng)的腦區(qū)。右側(cè)MCA阻斷后，使同側(cè)運(yùn)動(dòng)調(diào)控區(qū)發(fā)生損傷，因皮層交叉支配致左側(cè)肌無力，運(yùn)動(dòng)時(shí)左側(cè)旋轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出典型的追尾征或左側(cè)傾倒等癥狀。

實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠腦缺血6，12及24 h后，白色腦梗死灶依次加重，位于手術(shù)同側(cè)的額頂葉皮層、顳葉皮層和尾狀核及殼核外側(cè)部，與MCA支配的腦區(qū)域基本一致，同時(shí)神經(jīng)功能缺失癥狀逐漸加重，評(píng)分逐漸升高。以40，80及120 mg/kg的13-MTD干預(yù)后，腦梗死體積明顯縮小，且與神經(jīng)功能缺失評(píng)分有一定的關(guān)聯(lián)性，梗死體積縮小后，神經(jīng)功能缺失癥狀也得到相應(yīng)改善。3個(gè)劑量中，以80 mg/kg組的效果較好，且于缺血6 h時(shí)治療效果最好，說明缺血時(shí)間的長短對(duì)療效有直接影響，提示臨床上治療腦缺血性患者，應(yīng)在治療窗內(nèi)盡快疏通血管，以改善預(yù)后。既往實(shí)驗(yàn)表明，13-MTD可以抑制線粒體肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，使血糖降低，這種作用對(duì)缺血神經(jīng)細(xì)胞改善能量代謝起作用，特別是保護(hù)缺血半暗帶組織的功能可能起關(guān)鍵作用[11]。

研究表明，腦缺血損傷過程中，產(chǎn)生大量自由基攻擊細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸[12]，使膜脂質(zhì)過氧化，造成膜結(jié)構(gòu)破壞和鈉泵功能障礙[13]；脂質(zhì)過氧化也使膜不飽和脂肪酸減少，不飽和脂肪酸/蛋白質(zhì)比例失調(diào)，致使膜的液態(tài)性及流動(dòng)性降低，通透性增加，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，而缺血后ATP生成減少、乳酸堆積則加重了腦水腫，并與自由基之間相互作用，導(dǎo)致更為廣泛的腦損傷。缺血前30 min，尾靜脈注射不同劑量的13-MTD后，藥物可通過血液循環(huán)快速到達(dá)腦部，并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到血藥濃度高峰，在缺血發(fā)生前對(duì)組織進(jìn)行相應(yīng)的保護(hù)，而13-MTD本身是一種末端支鏈飽和脂肪酸，可作為細(xì)胞膜成分嵌入膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中，通過調(diào)節(jié)膜的組成而影響細(xì)胞功能，對(duì)細(xì)胞膜有穩(wěn)定作用并改善能量代謝，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。13-MTD 40，80及120 mg/kg均可降低腦組織的含水量并減小腦水腫體積，以13-MTD 80 mg/kg療效為佳。

實(shí)驗(yàn)研究13-MTD對(duì)BBB通透性改變的影響，伴隨著EB的滲出，損傷側(cè)腦組織存在一定的水腫現(xiàn)象，說明缺血損傷后BBB完整性的破壞與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。缺血時(shí)間越長，EB的滲出量越多，腦水腫的程度越重。13-MTD 40，80及120 mg/kg均可降低不同缺血時(shí)間后EB的滲出，以80 mg/kg的改善效果最好。EB滲出減少的同時(shí)，損傷側(cè)水腫也相應(yīng)減輕，提示13-MTD可改善腦缺血后BBB的通透性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。