羊肚菌菌絲體鋅多糖的體內(nèi)、體外抗氧化作用

冮 潔，王 艷，李佳桐，范麗娟，曹 蕾，龐士磊，劉文玲，陳濤濤

（大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600）

鋅是人體必需的微量元素，能促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)人體免疫機(jī)能[1]。全球近1/3的人口面臨著缺鋅引起的健康問題，缺鋅已成為影響人類健康的主要因素之一[2]。在我國(guó)，約50%的兒童表現(xiàn)出輕微的缺鋅癥狀，而在以谷類作物為主食的北方尤其是偏遠(yuǎn)地區(qū)，這種情況更為嚴(yán)重。鋅有“兒童生長(zhǎng)素”之稱，缺鋅可致免疫力低下、佝僂病、貧血、營(yíng)養(yǎng)不良及反復(fù)呼吸道感染，不同程度影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育[3-4]，甚至導(dǎo)致出現(xiàn)異食癖[5]。食用菌具有較強(qiáng)的富鋅能力，通過將鋅攝入食用菌菌絲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，將無機(jī)鋅結(jié)合到大分子活性物質(zhì)（如多糖和蛋白質(zhì)）上，形成有機(jī)鋅多糖和鋅蛋白，可以避免無機(jī)鋅的缺點(diǎn)，并更有利于有機(jī)鋅的免疫功能和食藥用菌的抗病功能的發(fā)揮[6]。鋅多糖作為第三代的補(bǔ)鋅產(chǎn)品，能被人體更高效、更安全地吸收利用。鋅多糖具有抗氧化的功效，陳宏偉等[7]研究蛹蟲草胞外鋅多糖的抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)鋅多糖對(duì)超氧陰離子自由基（）、羥自由基（?OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力與空白對(duì)照組相比分別提高了7.05%、23.50%和17.49%，胞外鋅多糖對(duì)自由基的清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈正向關(guān)系，實(shí)驗(yàn)證明鋅多糖具有明顯的抗氧化功效。李正鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)，樹舌胞外鋅多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 g/L時(shí)，對(duì)油脂過氧化物的抑制、?OH的清除、DPPH自由基和?的清除能力比對(duì)照組分別提高了12.50%、26.83%、30.00%、20.00%，胞外鋅多糖抗氧化活性與多糖質(zhì)量濃度呈顯著的量效關(guān)系。劉芳[9]在研究金針菇中的鋅多糖抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，多糖質(zhì)量濃度相同的條件下，鋅含量與抗氧化活性有一定的正相關(guān)性。目前，研究較多是鋅多糖體外抗氧化活性，對(duì)體內(nèi)抗氧化活性研究的較少。羊肚菌（Morchella esculenta），是一種名貴的大型食藥兼用真菌，羊肚菌多糖是其主要的活性成分之一，能夠保護(hù)肝臟損傷[10]、延緩細(xì)胞衰老[11]、減少脂褐質(zhì)的沉積[12]，對(duì)胃潰瘍[13]和胃黏膜有保護(hù)作用[14]，對(duì)輻射危害有輔助保護(hù)功能[15]，具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤的作用[16-18]。目前，羊肚菌沒有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工栽培[19]，主要采用菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法[20]，適合生產(chǎn)的工業(yè)化，且深層液體發(fā)酵培養(yǎng)的食用菌菌絲體與其子實(shí)體在化學(xué)組成、生理功能上都很相似[21]。液態(tài)培養(yǎng)提取出的羊肚菌胞外多糖有較明顯的抑制腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[22-23]。本課題組在已經(jīng)研究了羊肚菌菌絲體液體富鋅條件[24]和羊肚菌菌絲體硒多糖抗氧化活性的基礎(chǔ)上[25]，對(duì)羊肚菌菌絲體鋅多糖體內(nèi)、外抗氧化性進(jìn)行了研究，以期闡明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗氧化、抗衰老的功效，為食用菌鋅多糖的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

昆明種小鼠，雄性，（15±2）g，5～6 周齡，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。羊肚菌（M. esculenta）菌種由遼寧朝陽食用菌研究所提供。

DPPH、氮藍(lán)四唑、二硫蘇糖醇 美國(guó)Sigma-Aldirch公司；乙二胺四乙酸、Tris-HCl、硫酸亞鐵銨、鄰二氮菲、VC、鄰苯三酚、D-半乳糖、乙醇、HNO3、苯酚、硫酸、核黃素、聚乙烯吡咯烷酮、H2O2、硫代巴比妥酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Z-2000火焰原子吸收光譜儀 日本日立公司；BS223S精密電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ZHJH-C2112B超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；HYG-3多功能搖床 金壇市杰瑞爾電器有限公司；GRP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋公司；TDZ5-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基（綜合PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.0 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH值自然。菌種液體發(fā)酵采用不加瓊脂的綜合PDA培養(yǎng)基。

菌種活化：將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

菌種液體培養(yǎng)：將活化的斜面菌種4 塊（黃豆粒大?。┙臃N到裝有100 mL液體PDA綜合培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。

菌絲體液體培養(yǎng)：將PDA液體培養(yǎng)基中的菌液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5～7 d。發(fā)酵培養(yǎng)液5 000 r/min離心20 min，菌絲沉淀用蒸餾水洗滌3 次，菌絲體60 ℃干燥，測(cè)定其菌絲體多糖含量和鋅含量。富鋅組在培養(yǎng)基中加入600 mg/L硫酸鋅。不加鋅的為空白組。

1.3.2 多糖的提取及測(cè)定

采用熱水浸提法提取菌絲體多糖，料液比為1∶10（m/V），80 ℃水浴3 h，水浴浸提后過濾，濾液濃縮，加入無水乙醇溶液使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置于4 ℃冰箱內(nèi)醇沉12 h。取出后5 000 r/min離心15 min，沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液重復(fù)洗滌3 次，然后60 ℃干燥。

多糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸比色法[26]。菌絲體鋅含量的測(cè)定：采用微波消解-火焰原子吸收光譜法測(cè)定，富鋅率根據(jù)式（1）計(jì)算[24]。

式中：w為富鋅菌絲體鋅含量/（μg/g）；w0為空白菌絲體鋅含量/（μg/g）；ρ為培養(yǎng)基內(nèi)富鋅菌絲體質(zhì)量濃度/（μg/100 mL）；ρ0為培養(yǎng)基內(nèi)鋅質(zhì)量濃度/（μg/100 mL）。

1.3.3 體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.3.4 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

小鼠10 只為一組，正常飼養(yǎng)的為空白組；用每天腹腔注射D-半乳糖（100 mg/（kg?d））誘導(dǎo)致衰老小鼠作對(duì)照組；將羊肚菌菌絲體多糖溶于小鼠飲用水中，以每只小鼠飲用量為320 mg/（kg?d）進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)羊肚菌菌絲體多糖組小鼠為實(shí)驗(yàn)多糖組，喂養(yǎng)羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠為實(shí)驗(yàn)富鋅組。小鼠喂養(yǎng)條件：自然晝夜，節(jié)律光照，溫度（18±5）℃，相對(duì)濕度40%～60%。自然采食，連續(xù)喂養(yǎng)30 d后，空腹12 h期間只供給飲水，之后摘除眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min取血清，－20 ℃保存待用。脫臼處死，取肝和腎，用生理鹽水清洗，勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，－20 ℃保存待用。

1.3.5 抗氧化酶活力和MDA含量的測(cè)定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定[27]；過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測(cè)定采用紫外分光光度法[28]；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[29]。

1.3.6 小鼠臟器系數(shù)

臟器系數(shù)根據(jù)式（2）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌菌絲體多糖提取及富鋅率

采用液體深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行羊肚菌菌絲體富鋅培養(yǎng)，其菌絲體多糖提取和富鋅率計(jì)算結(jié)果如表1所示。

表1 羊肚菌菌絲體多糖提取結(jié)果和富鋅率Table1 Extraction yield and zinc enrichment percentage of polysaccharides from Morchella esculenta mycelium

由表1可知，羊肚菌菌絲體不加鋅培養(yǎng)，菌絲體中多糖含量為641.10 mg/g；而添加了鋅源培養(yǎng)的菌絲體中多糖含量為695.40 mg/g。說明添加鋅能促進(jìn)羊肚菌菌絲體多糖的合成。羊肚菌菌絲體具有較強(qiáng)的富鋅能力，富鋅率可達(dá)18.20%，提取的粗多糖中鋅含量可達(dá)0.860 mg/g。

2.2 羊肚菌菌絲體多糖體外抗氧化作用

2.2.1 羊肚菌菌絲體多糖?OH清除率

圖1 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)?OH清除率Fig. 1 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on hydroxyl free radicals

通過測(cè)定VC、羊肚菌菌絲體鋅多糖和沒添加鋅源的菌絲體多糖對(duì)鄰苯三酚的自氧化抑制作用來表明它們清除活性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)?的清除率Fig. 2 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on superoxide anion free radicals

0.48 mg/mL；未加鋅的羊肚菌菌絲體多糖的回歸方程為y＝70.5x＋6.77（R2＝0.991），IC50為0.61 mg/mL；VC的回歸方程為y＝79.835x＋19.544（R2＝0.986 1），IC50為0.38 mg/mL。對(duì)?清除作用大小為：VC＞羊肚菌菌絲體鋅多糖＞羊肚菌菌絲體多糖。羊肚菌菌絲體鋅多糖清除活性比羊肚菌菌絲體多糖提高27.08%。

2.2.3 羊肚菌菌絲體多糖DPPH自由基清除率

圖3 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)DPPH自由基的清除率Fig. 3 Scavenging effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on DPPH free radicals

由圖3可得，羊肚菌菌絲體鋅多糖清除DPPH自由基的回歸方程為y＝36.47x＋28.317（R2＝0.988 1），IC50為0.59 mg/mL；未加鋅的羊肚菌菌絲體多糖的回歸方程為y＝49.415x＋16.792（R2＝0.993），IC50為0.67 mg/mL；VC的回歸方程為y＝67.51x＋34.876（R2＝0.970 1），IC50為0.22 mg/mL。對(duì)DPPH自由基清除作用大小為：VC＞羊肚菌菌絲體鋅多糖＞羊肚菌菌絲體多糖。羊肚菌菌絲體鋅多糖清除DPPH自由基活性比羊肚菌菌絲體多糖提高13.56%。

2.3 羊肚菌菌絲體多糖體內(nèi)抗氧化作用

2.3.1 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

表2 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Table2 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on visceral organ indices in mice

對(duì)照組小鼠臟器系數(shù)變小，說明小鼠臟器發(fā)生萎縮或其他退行性改變，即小鼠衰老模型建模成功。羊肚菌菌絲體多糖組和羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠臟器系數(shù)均大于對(duì)照組，說明羊肚菌菌絲體多糖和羊肚菌菌絲體鋅多糖對(duì)衰老小鼠臟器萎縮均有抑制作用，羊肚菌菌絲體鋅多糖的抑制作用更強(qiáng)。

2.3.2 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)SOD活力的影響

由表3可見，羊肚菌菌絲體多糖組、羊肚菌菌絲體鋅多糖組和對(duì)照組小鼠SOD活力具有顯著性差異（P＜0.05），其中以肝臟最為顯著。與對(duì)照組相比，羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中SOD活力提高51.52%、血清SOD活力提高16.65%、腎臟SOD活力提高6.43%；未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中SOD活力提高38.60%、血清SOD活力提高12.09%、腎臟SOD活力提高4.08%。羊肚菌多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力明顯高于對(duì)照組，羊肚菌多糖可明顯提高SOD活力，從而達(dá)到抗氧化作用。而羊肚菌鋅多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力與羊肚菌菌絲體多糖組小鼠體內(nèi)的SOD活力具有顯著性差異，說明羊肚菌鋅多糖抗衰老效果更佳。

表3 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)SOD活力的影響Table3 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on SOD activity in mice U/mg

2.3.3 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)CAT活力的影響

表4 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)CAT活力的影響Table4 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on catalase activity in mice

表4結(jié)果表明，小鼠肝臟中，羊肚菌菌絲體多糖組和對(duì)照組無明顯差異，但羊肚菌菌絲體鋅多糖組與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中CAT活力提高81.08%，腎臟CAT活力提高75.56%；未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中CAT活力提高32.43%，腎臟CAT活力提高42.22%。羊肚菌菌絲體多糖可明顯提高小鼠體內(nèi)CAT活力，而羊肚菌菌絲體鋅多糖組小鼠體內(nèi)的CAT活力明顯高于羊肚菌多糖組，說明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗衰老效果更佳。多糖通過提高機(jī)體內(nèi)SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等的活力，間接清除自由基[25]。

2.3.4 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量的影響

表5結(jié)果表明，羊肚菌菌絲體多糖組、羊肚菌菌絲體鋅多糖組和對(duì)照組小鼠MDA具有顯著性差異（P＜0.05），其中以肝臟最為顯著。羊肚菌菌絲體鋅多糖使肝臟中MDA含量下降58.50%，血清MDA含量下降44.57%，腎臟MDA含量下降76.69%；未富鋅的羊肚菌菌絲體多糖使肝臟中MDA含量下降20.86%，血清MDA含量下降29.03%，腎臟MDA含量下降46.63%。羊肚菌菌絲體多糖組小鼠體內(nèi)的MDA含量明顯低于對(duì)照組，說明羊肚菌多糖可明顯減少小鼠體內(nèi)MDA含量，從而達(dá)到抗氧化作用。而羊肚菌鋅多糖組小鼠體內(nèi)的MDA含量與羊肚菌菌絲體多糖組也有顯著性差異，說明羊肚菌菌絲體鋅多糖抗衰老效果更佳。

表5 羊肚菌菌絲體多糖對(duì)小鼠體內(nèi)MDA含量的影響Table5 Effect of mycelial polysaccharides from Morchella esculenta mycelium on MDA content in mice nmol/mg

3 結(jié) 論

羊肚菌菌絲體具有較強(qiáng)的富鋅能力，通過液體深層培養(yǎng)其菌絲體富鋅率可達(dá)18.20%，提取的粗多糖中鋅含量可達(dá)0.86 mg/g。清除?OH、和DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了羊肚菌菌絲體多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化性，而通過富鋅培養(yǎng)獲得的羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更強(qiáng)的體外抗氧化活性。羊肚菌菌絲體多糖和羊肚菌富鋅菌絲體多糖能夠顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠肝臟、腎臟和血清中的SOD和CAT活力，降低MDA含量（P＜0.05）。并且，羊肚菌菌絲體鋅多糖比羊肚菌菌絲體多糖具有更強(qiáng)的抗衰老作用。