新型一步法制備環(huán)糊精有機(jī)聚合物整體柱及其應(yīng)用

郭嘉亮， 汪錦才， 黃若詩， 林航， 張婷婷

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 廣東 佛山 528000； 2. 暨南大學(xué) 藥學(xué)院， 廣東 廣州 510632)

由于獨(dú)特的理化性質(zhì)以及在分子識(shí)別能力上顯示出無可比擬的優(yōu)勢，環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)成為了眾多色譜固定相單體中最為熱門的研究對(duì)象之一[1-2].為了提高柱效，傳統(tǒng)環(huán)糊精色譜柱的填料顆粒需要一再減小，引致其背壓飆升，不僅不利于分離分析速度的提升，而且對(duì)儀器耐壓設(shè)計(jì)也提出了更嚴(yán)苛的要求.近年來，整體柱(monolithic column)由于易改性、柱容量大、適用于快速分離分析等優(yōu)勢而備受關(guān)注.其中，由有機(jī)聚合物整體柱材料與環(huán)糊精單體結(jié)合而成的環(huán)糊精聚合物整體柱，在手性拆分[2]、樣品富集[3]、固相萃取[4]、催化水解[5-6]等方面都發(fā)揮了重要作用，使得環(huán)糊精固定相得到嶄新發(fā)展.

目前常見的環(huán)糊精聚合物毛細(xì)管整體柱，通常是通過先制備基質(zhì)固定相，再進(jìn)行表面修飾得到.這種“兩步法”除了要求整體基質(zhì)具有合適的孔徑，還需預(yù)留可與功能化單體反應(yīng)的活性基團(tuán)，使之鍵合到整體材料表面，存在過程復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)事、重現(xiàn)性不佳等缺點(diǎn)[7].還有一種制備方法，就是利用可聚合的環(huán)糊精單體，混合生孔劑、交聯(lián)劑等，通過一步共聚合而直接制備整體柱.然而，這種“一步法”需含有可聚合雙鍵基團(tuán)的環(huán)糊精單體化合物，但通過化學(xué)修飾方式對(duì)環(huán)糊精引入可聚合雙鍵存在很多困難，因而造成可選擇的環(huán)糊精單體為數(shù)不多.此前，本課題組采用“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)的方法，合成了含甲基丙烯酸官能團(tuán)的β-環(huán)糊精衍生物單-6-(1H-1,2,3-三氮唑-4-甲基丙烯酸甲酯)-β-環(huán)糊精(PMA-BCD)，然后以此為單體通過原位聚合反應(yīng)一步法制備了新型的環(huán)糊精基質(zhì)的聚合物整體柱 poly(PMA-BCD-co-EDMA)(圖1，Column A)[8]；但具體應(yīng)用于手性拆分時(shí)，卻難以獲得良好結(jié)果.這可能是由于間隔臂(點(diǎn)擊反應(yīng)形成的剛性氮唑環(huán))影響了環(huán)糊精自身的柔性及空腔結(jié)構(gòu)造成.目前有關(guān)間隔臂對(duì)一步法制備的環(huán)糊精整體柱的影響仍鮮見報(bào)道.為證實(shí)這一猜想，本研究將合成具有間隔臂更長、柔性更佳的單體化合物單-6-甲基丙烯酰-乙二胺-6-脫氧-β-環(huán)糊精(MAC-EDA-BCD)，以此為功能性單體，EDMA為交聯(lián)劑，制備不同間隔臂的poly(MAC-EDA-BCD-co-EDMA)(圖1，Column B)，并進(jìn)一步考察其色譜性能.

圖1 整體柱的制備

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

甲基丙烯酰氯(methacryloyl chloride, MAC)，單-6-乙二胺-6-脫氧-β-環(huán)糊精(mono-6-ethylenediamine-6-deoxy-β-CD, EDA-BCD)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate, EDMA)、偶氮二異丁腈(azodiisobutyronitrile, AIBN)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、異丙醇(isopropanol, IPA)、4-氯-扁桃酸、2-溴-扁桃酸、莨菪酸、舒洛芬、甲苯、硫脲(上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)，乙腈為色譜純(默克化工).其他一般有機(jī)試劑購自廣州化學(xué)試劑廠.石英毛細(xì)管(375 μm O.D.×100 μm I.D.)(河北永年銳灃)，0.22 μm 濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司).

1.2 儀器及設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱攪拌器(河南予華儀器有限公司)、BSA223S 電子天平(德國Sartorius公司)、高壓泵(美國 Haskel)、LX-0.12/10A空氣壓縮機(jī)(上海魯辛實(shí)業(yè)有限公司)、ABI4000Q TRAP 三重四極桿質(zhì)譜儀(美國 AB 公司)、Vario EL元素分析儀(德國 Elementar 公司)、Merlin 高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國Zeiss)、SPD-15C 紫外檢測器(日本島津)、DiNa-S 納流泵(日本KYA)、Unimicro TrisepTM色譜工作站、Valco 四通閥(20 nL)、PB-10 pH 計(jì)(德國 Sartorius).

1.3 環(huán)糊精單體的制備

量取5.0 mL水與2.0 mL吡啶的混合液加入25 mL三頸圓底燒瓶內(nèi)，降溫至10 ℃，攪拌加入EDA-BCD(質(zhì)量1.0 g,摩爾數(shù)0.85 mmol)，攪拌溶解后，緩慢滴加MAC(質(zhì)量0.14 g,摩爾數(shù)1.34 mmol).控溫10～15 ℃攪拌反應(yīng)2 h后，加入50.0 mL水，攪拌5 min后靜置分液，有機(jī)相加入水萃取3次，每次30.0 mL，合并水相，加入乙酸乙酯洗滌3次(50.0 mL/次)，收集水相，攪拌下將水溶液緩慢滴入400.0 mL丙酮中，洗出固體，過濾、收集濾餅，得淡黃色固體，50 ℃熱風(fēng)干燥6 h，收料得固體化合物單-6-甲基丙烯酸酯-乙二胺-6-脫氧-β-環(huán)糊精(MAC-EDA-BCD, 質(zhì)量0.96 g, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)84.21%).MS (ESI):m/z=1 246.1[M+H]+(圖2).

圖2 環(huán)糊精單體的合成

1.4 環(huán)糊精聚合物整體柱的制備

參考文獻(xiàn)[1,7]報(bào)道預(yù)處理石英毛細(xì)管.將上述化學(xué)合成得到的MAC-EDA-BCD與交聯(lián)劑EDMA，引發(fā)劑AIBN，按一定的比例在合適的生孔劑系統(tǒng)(雙元生孔劑 DMSO/IPA)中超聲混合形成均勻溶液.溶液灌滿22 cm長度的預(yù)處理好的毛細(xì)管中，兩端用橡膠塞密封，60 ℃恒溫水浴反應(yīng)12 h.另參考文獻(xiàn)[8]，通過一系列的條件考察和配比優(yōu)化以后，后最終得到相應(yīng)的poly(MAC-EDA-BCD-co-EDMA) 整體柱(圖1，Column B).

1.5 整體柱的表征方法

參考本課題此前報(bào)道的方法[5-7]，包括掃描電鏡儀觀察形態(tài)學(xué)微觀結(jié)構(gòu)、元素分析儀測定整體柱組成、微徑液相法考察保留機(jī)理等，對(duì)石英毛細(xì)管進(jìn)行表征.

1.6 色譜流動(dòng)相的配制

所有流動(dòng)相和溶劑均是色譜純級(jí)別.流動(dòng)相是由有機(jī)相(ACN)和水相(H2O或緩沖鹽溶液)按照一定的比例混合均勻而成的，使用前需超聲脫氣處理.所用緩沖鹽溶液，包括磷酸二氫鉀(KH2PO4) 溶液和三乙胺乙酸酯(TEAAc)溶液，配制方法參考本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道.所有分析樣品一般溶解于溶劑ACN/H2O(VACN∶VH2O=85 ∶15)，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL，通過0.22 μm濾膜過濾備用.實(shí)驗(yàn)中所有樣品的檢測波長為214 nm.

1.7 分子對(duì)接

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為美國Tripos公司 Sybyl 8.1 軟件中的Sulflex-Dock模塊，Linux 操作系統(tǒng).除特別說明以外，所有參數(shù)均采用默認(rèn)值.全部配體小分子的預(yù)處理以及對(duì)接時(shí)的設(shè)定均為同等條件.結(jié)合本課題組的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道方法，對(duì)接研究采用的 β-環(huán)糊精晶體結(jié)構(gòu)下載于 PDB 數(shù)據(jù)庫(PDB Code: 2VQ4)，同時(shí)為減少其他影響，刪除所有水分子及其他蛋白、配體分子，然后通過修改6-位上羥基為氮唑環(huán)及乙二胺來構(gòu)建.手性配體4-溴扁桃酸小分子采用標(biāo)準(zhǔn)鍵長和鍵角，使用 Sketch Molecule 模塊繪制，并采用 Tripos 力場分子力學(xué)程序 Minimize 進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，負(fù)載 Gasteiger-Hückel 電荷，以 Powel 能量梯度法進(jìn)行能量優(yōu)化，最大優(yōu)化次數(shù)為2 000次，能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為 0.001 kcal/mol，優(yōu)化以確保結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.通過Surflex-Dock程序?qū)σ呀?jīng)準(zhǔn)備好的4-溴扁桃酸與 β-環(huán)糊精晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，并為對(duì)接結(jié)果打分.設(shè)置口袋閾值(threshould)值為0.5，膨脹系數(shù)(bload)為 2，然后通過運(yùn)算形成活性口袋，其他均為默認(rèn)設(shè)置.Surflex-Dock 打分函數(shù)以 -lgKd為單位模擬結(jié)合能力，得分越高的構(gòu)象被認(rèn)為是最佳構(gòu)象.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 整體柱的制備配比優(yōu)化

參考Column A的制備經(jīng)驗(yàn)[8]，優(yōu)化Column B的制備配比(表1).初步制備得到的整體柱B1，在毛細(xì)管內(nèi)出現(xiàn)非常致密的透明膠體狀結(jié)構(gòu)；在B1的基礎(chǔ)上調(diào)整生孔劑的質(zhì)量比wDMSO/wIPA=75.0 ∶25.0調(diào)至70.0 ∶30.0(B2)，B2形成的膠狀結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)部分聚合物；B3在B2的基礎(chǔ)上增加交聯(lián)劑EDMA的比例，成膠情況得以解除，但是聚合結(jié)構(gòu)過于松垮；調(diào)整單體與生孔劑的質(zhì)量比從20.0 ∶80.0(B3)調(diào)至25.0 ∶75.0(B4)，B4聚合結(jié)構(gòu)偏致密，通透性不太理想；優(yōu)化生孔劑質(zhì)量比wDMSO/wIPA從70.0 ∶30.0(B4)調(diào)至65.0 ∶40.0(B5)，最終得出B5聚合最均勻且通透性良好，因此采用該配比進(jìn)行后續(xù)的研究.

表1整體柱的制備及優(yōu)化

Table1Compositionsofthepolymerizationmixturesusedforthepreparationofmonolithiccolumnsandthecorrespondingpermeabilities

No.Monomer MixturePorogen SolventMonomer: PorogenMAC-EDA-β-CD/%EDMA/%DMSO/%IPA/%Monomer/%Porogen/%Permeability KB172.028.075.025.020.080.0GelB272.028.070.030.020.080.0GelB367.432.670.030.020.080.0Too slackB467.432.670.030.025.075.07.91 Mpa/(×10-14m2)B567.432.665.035.025.075.0GoodB667.432.667.532.525.075.03.32 Mpa/(×10-14m2)

2.2 整體柱的理化性質(zhì)表征

通過掃描電子顯微鏡成像觀察整體柱內(nèi)聚合物的微觀結(jié)構(gòu)信息.毛細(xì)管整體柱的橫切面可以直觀反映原位聚合的情況以及材料的形貌(包括大孔、中孔或小孔結(jié)構(gòu)).結(jié)果顯示，整體柱在總體形態(tài)上呈現(xiàn)聚合良好的顆粒米狀，聚合物與毛細(xì)管內(nèi)壁緊密結(jié)合，同時(shí)聚合物骨架孔徑分布比例恰當(dāng)，未見坍塌情況，聚合微球均勻分布(圖3).小孔保證了固定相比表面積，大孔則保證了整體柱的良好通透性能.

通過元素分析的結(jié)果考察Column B的化學(xué)組成.制備得到的整體材料C、O、H的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為56.97%、35.45% 和6.95%.已知MAC-EDA-BCD的C、O、H的理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.30%、44.97% 和6.48%；EDMA的 C、O、H的理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為60.59%、32.29% 和7.12%.根據(jù)元素分析結(jié)果分析，聚合物中MAC-EDA-BCD與交聯(lián)劑EDMA的摩爾比約為1∶3，與投料比基本符合，證明聚合情況符合預(yù)期；同時(shí)，環(huán)糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)也與Column A基本相當(dāng)[8]，適合用于下一步的對(duì)比評(píng)估.

圖3 整體柱的掃描電鏡圖

通過微徑液相色譜法表征整體柱的保留機(jī)理.以非極性化合物甲苯和極性化合物硫脲為測試化合物，乙腈、水為流動(dòng)相.通過改變流動(dòng)相中乙腈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，考察甲苯和硫脲的保留時(shí)間的變化(圖4).當(dāng)乙腈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于80% 時(shí)，甲苯的保留時(shí)間隨著乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著降低，而硫脲的保留時(shí)間基本不變；乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于80% 時(shí)，甲苯的保留時(shí)間基本不變，而硫脲的保留時(shí)間有所增長.由此可見，Column B的保留機(jī)理是一種包含親水作用與反相作用的雙重保留模式，這與Column A是一致的[8]，說明兩者的保留機(jī)理并沒有顯著差異.

圖4 乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)與保留時(shí)間的關(guān)系

2.3 整體柱的手性拆分效果

本實(shí)驗(yàn)采用4種手性藥物及中間體作為評(píng)估對(duì)象，對(duì)Column A和Column B的手性拆分能力進(jìn)行對(duì)比，考察不同間隔臂對(duì)β-環(huán)糊精整體柱手性分離能力的影響.從表2可以看到，Column B的手性分離效果明顯優(yōu)于Column A.以2-溴扁桃酸為例(圖5)，在分離條件一致的條件下，其在Column A和Column B整體柱上的分離度Rs分別為0.42和1.71.手性分離結(jié)果表明，相對(duì)于前期研究[8]得到的Column A，Column B整體柱手性分離能力更佳.

表24種手性化合物在ColumnA和ColumnB上的手性分離效果

Table2EnantioseparationsoffourchiralcompoundsontheColumnAandColumnB

樣品Column AColumn BαRsαRs4-氯-扁桃酸a1.140.321.392.352-溴-扁桃酸a1.070.421.271.71莨菪酸b1.070.551.451.46舒洛芬b1.201.331.231.65

流動(dòng)相: (a)VACN∶VH2O=70∶30 containing 20 mmol/L KH2PO4, pH=4.20; (b)VACN∶VH2O=70 ∶30 containing 0.2% TEAAc, pH=4.20.

圖5 4種手性藥物在Column A 和 Column B 整體柱上的手性分離效果

Fig.5 Enantioseparation of 4 chiral drugs obtained on Column A and Column B

2.4 整體柱的手性識(shí)別機(jī)理的研究

利用分子對(duì)接手段，依據(jù)配體與受體作用的“鎖-鑰原理”(lock and key principle)，有助于揭示 β-環(huán)糊精對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的拆分作用機(jī)理[9].通過對(duì) PMA-BCD 和 EDA-BCD 與手性化合物 2-溴扁桃酸進(jìn)行對(duì)接研究(圖6).圖6 a、b 分別顯示為 S- 及 R-2-溴扁桃酸與 PMA-BCD 對(duì)接后的圖示；圖6 c、d 則分別顯示為 S- 及 R-2-溴扁桃酸與 EDA-BCD 對(duì)接后的圖示，可見 2-溴扁桃酸分子是以母環(huán)插入到 β-環(huán)糊精分子的疏水性空腔中，苯環(huán)的分子直徑約為 5 ?，比 β-環(huán)糊精的內(nèi)徑 6.5 ? 略小，故通過苯環(huán)的插入形成包合物是合理的.并且由于苯環(huán)的插入，導(dǎo)致苯環(huán)上的手性羥基和羧基與環(huán)糊精大口側(cè)的羥基空間距離靠近，形成強(qiáng)分子間氫鍵，使包合物更加穩(wěn)定.因此，以此作為對(duì)接模型來研究 2-溴扁桃酸異構(gòu)體的手性識(shí)別是合理的.

對(duì)接打分函數(shù)值如表3、表4所示.對(duì) PMA-BCD 而言，最有代表性的 CScore 模塊，所得分?jǐn)?shù)相差無幾，同為4；對(duì) EDA-BCD 而言，R-2-溴扁桃酸與 S-2-溴扁桃酸的打分函數(shù)值為 2.740 0 和 2.730 0，但其他分?jǐn)?shù) (D_score、G_score、PMF_score、ChemScore、CScore)卻存在著明顯差別，最有代表性的 CScore 分別為1和4.從中發(fā)現(xiàn)，R-2-溴扁桃酸與 EDA-BCD的氫鍵作用顯然要強(qiáng)于 S-2-溴扁桃酸，其分離主要原因可能是基于氫鍵作用力.

圖6 2-溴扁桃酸不同對(duì)映異構(gòu)體與 PMA-BCD (-S/-R(a)/(b)) 以及 EDA-BCD (-S/-R(c)/(d)) 分子對(duì)接的結(jié)果

Fig.6 The inclusion complexes of PMA-BCD and 2-bromo-mandelic acid racemate (-S/-R(a)/(b)) and the inclusion complexes of EDA-BCD and 2-bromo-mandelic acid racemate (-S/-R(c)/(d))

表3 2-溴扁桃酸2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體與 PMA-BCD 的6種分子對(duì)接分?jǐn)?shù)Table 3 The Surflex-Dock scores of 2-bromo-mandelic racemates dock with PMA-BCD

表4 2-溴扁桃酸2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體與 EDA-BCD 的6種分子對(duì)接分?jǐn)?shù)Table 4 The Surflex-Dock scores of 2-bromo-mandelic racemates dock with EDA-BCD

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)一步法制備環(huán)糊精有機(jī)聚合物整體柱進(jìn)行深入探討，以前期已有研究基礎(chǔ)的PMA-BCD以及MAC-EDA-BCD為功能性配體，EDMA為交聯(lián)劑，制得不同間隔臂的整體柱Column A 和 Column B，考察間隔臂對(duì)本法制備整體柱的影響.其中，Column B為首次報(bào)道.實(shí)驗(yàn)證明，Column B手性拆分效果優(yōu)于Column A.影響化合物對(duì)映體在液相色譜中保留行為的因素很多，其中β-環(huán)糊精與對(duì)映體間結(jié)合物的穩(wěn)定性差異是其主要因素[10-11].而其穩(wěn)定性差異可在 Surflex-Dock 的結(jié)果 scores值上體現(xiàn)，即scores值越高，小分子與環(huán)糊精間相互作用越強(qiáng)，結(jié)合越牢固，形成結(jié)合物的穩(wěn)定性越高.本實(shí)驗(yàn)中，R-2-溴扁桃酸與 S-2-溴扁桃酸的 CScore 差別顯著，分別是4和1，R-2-溴扁桃酸形成的結(jié)合物更穩(wěn)定，在色譜分離過程中后被洗脫，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，表明分子對(duì)接有助于解釋對(duì)映異構(gòu)體的保留順序.綜上，Column A 和 Column B在手性分離效果上的差別原因可能由于前者單體間隔臂是剛性氮唑環(huán)，其空間位阻太大[8,10]，間隔太短影響了環(huán)狀柔性環(huán)糊精的空腔結(jié)構(gòu)，而后者因?yàn)槿嵝缘囊叶愤B接方式，保證了環(huán)糊精足夠的柔性，導(dǎo)致兩者的差別.