青蒿琥酯對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響及其可能機制

溫麗娟， 余韜， 魏鳳香

(1.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院， 廣東 深圳 518172； 2.遵義醫(yī)學院， 貴州 遵義 563000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，資料顯示，近年我國乳腺癌標準人群粗發(fā)病率約為42.02/10萬，年齡標化發(fā)病率約為30.41/10萬[1].作為乳腺癌的一種亞型，三陰性乳腺癌即雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體-2 (HER-2)的表達均為陰性的乳腺癌，約占乳腺癌發(fā)病總數(shù)的15%～20%[2].三陰乳腺癌易出現(xiàn)早期的復發(fā)轉移，且缺乏有效的靶向治療藥物，病死率高，預后不良，因此針對該病開發(fā)新型的化療藥物仍是一個亟待解決的問題.青蒿琥酯(artesunate, ART)是中藥青蒿素的衍生物，以往主要用于抗瘧疾治療，近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)青篙素類藥物具有較為顯著的抗腫瘤活性[3-4]，其中，ART可在體外細胞試驗中對前列腺癌[5]、胃癌[6]及部分類型的白血病細胞[7]等一系列腫瘤細胞系產(chǎn)生明顯的抑制作用.DNA損傷反應(DNA damage response, DDR)是保證基因組穩(wěn)定性的重要機制，同時也是許多抗腫瘤藥物的作用靶點.本研究將ART作用于三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞，觀察其對該細胞株的增殖、遷移、侵襲能力以及細胞周期的影響，并研究ART對DNA損傷反應通路的作用，以期為ART抗腫瘤作用及其機制的研究及三陰乳腺癌新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自武漢中國典藏物培養(yǎng)中心.

1.1.2 試劑

青蒿琥酯(sigma公司)，以DMSO溶解為質(zhì)量濃度為200 mg/mL的溶液，-20 ℃分裝保存，使用時以培養(yǎng)基稀釋；二甲基亞颯即DMSO(sigma公司)；四甲基偶氮哇鹽即MTT(Gibco公司)，以PBS溶液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL于-20 ℃分裝保存；結晶紫(天津大茂公司)，以PBS溶液配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%或1%溶液于4 ℃保存；Matrigel膠(Thermo公司)；RNase及碘化丙陡即PI(碧云天公司)；兔抗人γH2AX、p-ATM、p-CHK2及山羊抗兔IgG(cell signaling 公司)；DMEM高糖基礎培養(yǎng)基(Thermo公司)；胎牛血清即FBS(杭州四季青公司).

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制率

對數(shù)期乳腺癌MDA-MB-231細胞以8 000/孔接種于96孔板中，于體積分數(shù)為5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后，以不同質(zhì)量濃度ART(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 μg/mL)分別作用24、48、72 h，其中質(zhì)量濃度0 μg/mL為正常對照組，其余為實驗組，同時設置空白對照組(不含細胞及藥物)，每組設6個復孔，常規(guī)培養(yǎng)到達目標時間后，吸出各孔液體，每孔加人質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL MTT溶液100 μL，4 h后棄去，每孔加人DMSO 150 μL，震蕩20 min，于酶標儀490 nm波長處檢測各孔吸光度并計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=

(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%.

1.2.2 結晶紫法觀察細胞形態(tài)

對數(shù)期乳腺癌MDA-MB-231細胞以5×105/孔接種于6孔板中，以不同質(zhì)量濃度ART(200、100、50、25、12.5、0 μg/mL)作用48 h，吸出各孔液體，PBS輕洗，每孔加入質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛溶液固定30 min后，PBS輕洗，加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%結晶紫溶液染色10 min，PBS輕洗，觀察拍照.

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

對數(shù)期乳腺癌MDA-MB-231細胞以5×105/孔接種于6孔板中，待細胞平鋪長滿，用無菌10 μL移液器吸頭于各孔內(nèi)垂直劃線，預熱PBS溶液洗去飄浮細胞后，觀察拍照；以無血清DMEM培養(yǎng)基配制ART(質(zhì)量濃度50 μg/mL)，作用24、48 h觀察拍照.

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

Matrigel膠以1∶6的體積比與培養(yǎng)基混合，取40 μL加入孔徑為8.0 μm的Transwell上室中，37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h.待Matrigel凝固后，將600 μL含不同質(zhì)量濃度ART(100、50、25、0 μg/mL)及質(zhì)量分數(shù)為20%FBS的培養(yǎng)基加入下室，將100 μL含不同質(zhì)量濃度ART(100、50、25、0 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基分別重懸1×105細胞，并加入上室， 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.取出上室，于質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛溶液固定30 min，擦除上室基質(zhì)膠，并用質(zhì)量分數(shù)為1%結晶紫溶液染色，顯微鏡下觀察拍照，并計數(shù)各孔中的5個視野細胞數(shù)，計算平均值.

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

對數(shù)期乳腺癌MDA-MB-231細胞以5×105/孔接種于6孔板中，以不同質(zhì)量濃度ART(100、50、25、0 μg/mL)作用48 h，收集各組細胞，離心棄上清，以PBS重懸細胞，離心棄上清，加入體積分數(shù)為70%的乙醇于-20 ℃過夜固定，次日進行PI染色，流式細胞儀測定細胞周期.

1.2.6 Western blotting檢測DNA損傷反應相關蛋白表達

對數(shù)期乳腺癌MDA-MB-231細胞以5×105/孔接種于6孔板中，以不同質(zhì)量濃度ART(100、50、25、0 μg/mL)作用48 h，提取總蛋白，BCA法定量，而后進行變性及上樣，SDS-PAGE電泳分離后，濕轉至NC膜.用質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜.次日，TEST洗滌3×5 min，以HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TEST洗滌3×5 min，ECL化學發(fā)光法進行顯影.用Imagine J軟件進行灰度分析.以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值之比.

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制率

不同質(zhì)量濃度ART分別作用24、48、72 h所得細胞增殖抑制率如表1、圖1所示.將同一時間點實驗組與對照組細胞增殖抑制率進行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，隨著藥物質(zhì)量濃度的升高，細胞增殖抑制率逐漸升高；藥物處理24 h時，在所設藥物質(zhì)量濃度分組中，藥物質(zhì)量濃度≥50 μg/mL時，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；藥物處理48 h時，在所設藥物質(zhì)量濃度分組中，藥物質(zhì)量濃度≥6.25 μg/mL時，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；藥物處理72 h時，與對照組相比，所設藥物質(zhì)量濃度分組均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05).

表1不同質(zhì)量濃度ART對MDA-MB-231細胞增殖的影響

Table 1 Effects of different concentrations of ART on proliferation of MDA-MB-231 cells%

1)與對照組比較P<0.05.P<0.05vsControl group.

圖1 不同質(zhì)量濃度ART對 MDA-MB-231細胞增殖的影響

Fig.1 Effects of different concentrations of ART on proliferation of MDA-MB-231 cells

2.2 結晶紫法檢測細胞存活情況

不同質(zhì)量濃度ART作用48 h所得細胞結晶紫染色結果如圖2所示.4×10光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)結晶紫染色后，細胞核呈深紫色，胞漿呈淡紫色.與對照組相比，實驗組細胞正常結構改變，排列疏松，部分分離變圓，可見不規(guī)則形狀的深染細胞碎片.隨著實驗組用藥質(zhì)量濃度的升高，細胞數(shù)量逐漸減少，細胞形態(tài)不規(guī)則程度逐漸加深，形態(tài)不規(guī)則細胞所占比例逐漸增高.

1)A、B、C、D、E、F分別代表ART質(zhì)量濃度為0、12.5、25、50、100、200 μg/mL細胞結晶紫染色結果.

1) A, B, C, D, E, and F represent the results of crystal violet staining when the concentrations of ART were 0, 50, 75, 100, 150, and 200 μg/mL respectively.

圖2 不同質(zhì)量濃度ART對 MDA-MB-231細胞增殖的作用結晶紫染色結果(4×10)

Fig.2 Effects of different concentrations of ART on MDA-MB-231 cell proliferation by crystal violet staining (4×10)

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

ART質(zhì)量濃度為0、50 μg/mL，作用0、24、48 h所得劃痕實驗結果如圖3所示.經(jīng)ART (50 μg/mL)處理0、24、48 h后，與對照組相比，實驗組乳腺癌MDA-MB-231細胞發(fā)生遷移的細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，平均體外遷移距離顯著降低(P<0.05).

2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

不同質(zhì)量濃度ART作用24 h對MDA-MB-231細胞體外侵襲能力的影響如圖4所示.10×10光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組侵襲細胞數(shù)量明顯減少，且隨著藥物質(zhì)量濃度的升高，侵襲細胞數(shù)量進一步減少，經(jīng)單因素方差分析，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05).細胞形態(tài)上，實驗組侵襲細胞較對照組排列疏松，部分細胞失去偽足而呈現(xiàn)不規(guī)則形，且藥物質(zhì)量濃度越高越明顯.

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

不同質(zhì)量濃度ART作用48 h對MDA-MB-231細胞周期的影響如圖5、表2所示.與對照組相比，隨著藥物質(zhì)量濃度的升高，實驗組G2/M期細胞所占比例逐漸升高.實驗結果經(jīng)單因素方差分析顯示，與對照組相比，各實驗組G2/M期細胞所占比例均顯著升高(P<0.05)；與藥物質(zhì)量濃度為25 μg/mL組相比，藥物質(zhì)量濃度為50 μg/mL組及100 μg/mL組中G2/M期細胞所占比例也顯著升高(P<0.05)；但質(zhì)量濃度為50 μg/mL組及100 μg/mL組G2/M期細胞所占比例未見明顯差異.

1)A1、A2、A3分別代表ART質(zhì)量濃度為0 μg/mL時，作用0、24、48 h的結果；B1、B2、B3分別代表ART質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，作用0、24、48 h的結果.

1) A1, A2, and A3 represent the results of 0, 24, and 48 h when the mass concentration of ART was 0 μg/mL;B1, B2, and B3 represent the results of 0, 24, and 48 h when the mass concentration of ART was 50 μg/mL.

圖3 劃痕試驗檢測ART對 MDA-MB-231細胞遷移能力的影響實驗結果(4×10)

Fig.3 Effects of ART on the migration of MDA-MB-231 cells by cell scratch test (4×10)

1)A、B、C、D的ART質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100 μg/mL.

1) The ART concentrations of A, B, C, and D were 0, 25, 50, and 100 μg/mL, respectively.

圖4 不同質(zhì)量濃度ART作用24h對MDA-MB-231細胞體外侵襲能力的影響(10×10)

Fig.4 Effects of different concentrations of ART on the in vitro invasion of MDA-MB-231 cells for 24 h (10×10)

1)A、B、C、D的ART質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100 μg/mL.

1) The ART concentrations of A, B, C, and D were 0, 25, 50, and 100 μg/mL, respectively.

圖5 不同質(zhì)量濃度ART作用48 h對MDA-MB-231細胞周期的影響

Fig.5 Effects of different concentrations of ART on the cell cycle of MDA-MB-231 for 48 h

表2不同質(zhì)量濃度ART作用48h對MDA-MB-231細胞周期的影響

ρART/(μg·mL-1)細胞周期分布/%G0/G1SG2/M063.86±2.0815.61±0.8620.52±1.482555.58±1.7216.16±1.0728.26±0.71)5035.35±1.3216.53±0.7348.11±1.891),2)10031.66±1.7216.31±1.1852.02±1.371),2)

1)與對照組比較P<0.05；2)與質(zhì)量濃度25 μg/mL組比較P<0.05.

1)P<0.05vsControl group; 2)P<0.05vsthe group ofρART=25 μg/mL.

2.6 Western blotting檢測DNA損傷反應相關蛋白表達

不同質(zhì)量濃度ART作用48 h對MDA-MB-231細胞DNA損傷反應通路相關蛋白的影響如圖6所示.結果顯示對照組γH2AX(S139)，phospho-ATM(S1981)，phospho-CHK2(T68)幾乎不表達，與之相比，實驗組上述蛋白相對表達量均升高(P<0.05)，且隨著藥物質(zhì)量濃度的升高，蛋白相對表達量進一步升高，與藥物質(zhì)量濃度為25 μg/mL組相比，50及100 μg/mL組γH2AX(S139)，phospho-ATM(S1981)，phospho-CHK2(T68)蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，與藥物質(zhì)量濃度為50 μg/mL組相比，100 μg/mL組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05).

圖6 ART對 MDA-MB-231細胞DNA損傷反應通路相關蛋白的影響

Fig.6 Effects of ART on DNA damage response pathway related proteins in MDA-MB-231 cells

3 討論

三陰乳腺癌具有發(fā)病年輕化、腫瘤生長快、惡性程度高、易轉移、易復發(fā)、預后差等特點，其雌孕激素受體及HER-2受體均呈現(xiàn)陰性，目前常用的內(nèi)分泌治療和分子靶向治療對三陰乳腺癌均未能達到較為滿意的療效，化療仍是該病目前的主要治療手段之一[8].近年發(fā)現(xiàn)部分中藥提取成分抗腫瘤效果顯著[9]，青蒿素類藥物便是其中之一，其抗腫瘤作用機制可能與腫瘤細胞內(nèi)自由基及活性氧簇的產(chǎn)生、細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡和抗腫瘤血管生成等相關[10].

相關研究表明，ART對乳腺癌細胞具有一定增殖抑制作用，Tran等[11]的研究發(fā)現(xiàn)ART對乳腺癌MCF7及MDA-MB-231細胞的增殖具有抑制作用，并且當納米結構脂質(zhì)載體包裹ART后，MCF7及MDA-MB-231細胞的凋亡率顯著增高；在對腫瘤細胞遷移能力、侵襲能力的影響方面，相關研究也證實了ART的抑制作用，Shi等[12]應用與本研究類似的細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗，發(fā)現(xiàn)ART可抑制食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞的體外遷移和侵襲能力，并猜測該作用可能與細胞機械性能的改變有關.在ART對腫瘤細胞周期的影響方面，Greenshields等[13]研究表明ART能夠在體外及裸鼠體內(nèi)抑制卵巢癌細胞的生長，并將其阻滯于G2/M期，研究認為該阻滯很可能與活性氧系統(tǒng)的激活有關.本研究與上述研究結果相一致，ART能夠顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外增殖能力，在藥物質(zhì)量濃度0～200 μg/mL時，隨藥物濃度的增加、作用時間的延長，增殖抑制作用逐漸增強，同時，該藥物能夠在50 μg/ml時抑制MDA-MB-231細胞的體外遷移能力，并在質(zhì)量濃度25、50、100 μg/mL時，呈濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞的體外侵襲細胞數(shù)量.此外，本研究顯示MDA-MB-231細胞在ART處理后，G2/M期細胞所占比例顯著增高，細胞周期發(fā)生了G2/M期阻滯.

為了探討ART引起以上抑制作用的可能機制，本研究進行了Western blot實驗以檢測DNA損傷反應通路中相關蛋白水平.DNA損傷反應是當DNA受到損傷時細胞所產(chǎn)生的細胞周期阻滯并進行DNA修復的過程，DNA雙鏈斷裂是最嚴重的DNA損傷形式[14]，當雙鏈斷裂發(fā)生時，首先引起ATM蛋白的磷酸化產(chǎn)生phospho-ATM(S1981)，而后形成磷酸化的組蛋白γH2AX(S139)，后經(jīng)一系列下游激活達到DNA修復的目的，與此同時，phospho-ATM(S1981)也使其下游分子CHK2激活為phospho-CHK2(T68)，最終引起細胞周期阻滯，為DNA修復提供充足的時間，經(jīng)上述過程以保證基因組的完整和穩(wěn)定，但當DNA損傷過于嚴重以至不能修復時，細胞則不能繼續(xù)存活[15]，許多抗腫瘤藥物都通過造成不同形式的DNA損傷來實現(xiàn)抗腫瘤的作用.本研究所檢測的γH2AX(S139)蛋白，形成常作為DNA損傷早期的標志性事件，目前被認為是DNA損傷發(fā)生的生物標志[16]；而phospho-ATM(S1981)的激活常與DNA雙鏈斷裂的發(fā)生密切相關[17]；phospho-CHK2(T68)作為phospho-ATM(S1981)的下游分子，以及參與細胞周期阻滯的重要分子[17]，其激活在一定程度上說明了DNA損傷反應通路的激活.本研究結果顯示ART處理組中γH2AX(S139)、phospho-ATM(S1981)、phospho-CHK2(T68)的蛋白水平均較對照組發(fā)生了具有統(tǒng)計學意義的增高，說明MDA-MB-231細胞極有可能在ART的作用下發(fā)生了DNA損傷反應，推測ART對MDA-MB-231細胞的抑制作用可能與DNA損傷反應的發(fā)生有關.

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ART能夠抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并使MDA-MB-231細胞發(fā)生G2/M期阻滯，上述結果可能是由γH2AX(S139)、phospho-ATM(S1981)、phospho-CHK2(T68)等蛋白的激活所引起的DNA損傷反應通路的激活導致的.