肝組織病毒學(xué)檢測(cè)對(duì)血清HCV RNA陰性慢性HCV感染者診治價(jià)值探討

寇 艷，紀(jì)風(fēng)兵，范 凌，羅鳳蓮

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科，四川 成都 610500)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的病毒性感染，主要經(jīng)針刺、吸毒、血液系統(tǒng)傳播[1]。統(tǒng)計(jì)顯示，世界范圍內(nèi)HCV感染率約為3%，每年新發(fā)丙型肝炎病例逾3萬(wàn)人次，可引起肝臟慢性組織炎癥及肝纖維化，嚴(yán)重者可能進(jìn)展為肝硬化及肝細(xì)胞肝癌，威脅患者生命安全[2]。目前用于HCV感染的常規(guī)檢測(cè)方法包括抗-HCV及血清HCV RNA定量檢測(cè)，其中抗HCV產(chǎn)生是HCV感染的重要標(biāo)志，但研究發(fā)現(xiàn)，抗-HCV檢測(cè)特異性較低，受機(jī)體免疫狀態(tài)影響較大[3]。而血清HCV RNA定量則可直接測(cè)定患者外周HCV RNA水平，有較高的特異性，可確診HCV感染，監(jiān)測(cè)HCV病毒復(fù)制及抗病毒免疫應(yīng)答狀況。但受到機(jī)體免疫差異、血清HCV RNA水平低、肝硬化HCV復(fù)制空間有限等因素的影響，部分HCV感染患者無(wú)法檢出血清HCV RNA陽(yáng)性，一般將此類患者成為隱匿性HCV感染。對(duì)部分血清學(xué)HCV RNA陰性但易出現(xiàn)外周血細(xì)胞減少癥、脾腫大及肝臟形態(tài)學(xué)改變的患者，若未及時(shí)確診，導(dǎo)致治療延誤，則可引起病情不可逆進(jìn)展，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[4]。本研究對(duì)血清學(xué)HCV RNA常規(guī)檢查無(wú)法明確慢性HCV感染的肝病患者展開(kāi)經(jīng)皮穿刺肝組織活檢，進(jìn)行肝組織HCV RNA定量及基因型檢查，旨在明確血清學(xué)HCV RNA陰性慢性HCV感染患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性情況，并指導(dǎo)抗病毒治療，以評(píng)價(jià)肝組織病毒學(xué)檢測(cè)對(duì)血清HCV RNA陰性慢性HCV感染患者的臨床診療價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料2012年2月至2015年5月我院收治的46例血清HCV RNA陰性慢性HCV感染患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：抗-HCV陽(yáng)性，伴或不伴肝功能影像學(xué)異常、肝功能異常，或抗-HCV陰性，但伴反復(fù)肝功能異?；蚋闻K影像學(xué)異常；連續(xù)測(cè)定3次血清HCV RNA陰性；無(wú)經(jīng)皮穿肝組織活檢禁忌證；獲得患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)法配合經(jīng)皮肝穿活檢者；既往有不明原因出血史或有出血傾向者；合并肝血管瘤或其他血管性腫瘤者；無(wú)法確定合適穿刺點(diǎn)者；合并肝包蟲病者；合并凝血功能障礙者；入組10天內(nèi)應(yīng)用非甾體類抗炎藥物者；合并大量腹水者；腹腔、胸腔嚴(yán)重感染者；合并自身免疫功能缺陷者；有癥狀性心臟病者；既往接受抗病毒治療者；合并乙型肝炎病毒(HBV)感染、代謝性肝病、藥物性肝病等；失代償期肝硬化者；合并精神疾病者；妊娠或哺乳期女性。其中男20例，女26例；年齡22～75歲[(46.6±5.7)歲]；體重指數(shù)(BMI)(25.5±4.5)kg/m2；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(139.5±59.5)IU/L，甘油三酯(TG)(2.8±1.8)mmol/L；血糖(6.8±3.3)mmol/L。

1.2方法①肝組織HCV RNA測(cè)定。所有患者入院后均行凝血常規(guī)、血常規(guī)及肝臟影像學(xué)檢查，確定無(wú)經(jīng)皮穿刺肝組織活檢禁忌證。在彩色多普勒超聲指導(dǎo)下定位穿刺點(diǎn)，確定穿刺深度，常規(guī)消毒穿刺點(diǎn)周圍皮膚，無(wú)菌鋪巾，1%利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉，麻醉起效后采用18 G半自動(dòng)活檢肝穿刺針行快速經(jīng)皮穿刺肝組織活檢，均取材2次，肝組織標(biāo)本長(zhǎng)度超過(guò)15 mm，福爾馬林溶液固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，經(jīng)行HE、Masson及嗜銀網(wǎng)狀纖維染色，光鏡下觀察，進(jìn)行肝組織病理炎癥壞死評(píng)分(Knodell HAI評(píng)分系統(tǒng))及肝纖維評(píng)分(Ishak評(píng)分)。并留取外周血標(biāo)本，血清HCV RNA、肝組織HCV RNA定量采用熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)法(PCR)，采用羅氏公司LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自深圳凱杰生物工程有限公司。②血清抗-HCV測(cè)定。均留取外周血標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗-HCV，試劑盒購(gòu)自中山生物工程有限公司，采用SEAC公司Alisei全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)測(cè)定，樣品光密度值(OD值)≥臨界值(cut-off值)視為抗-HCV陽(yáng)性，比較抗-HCV陽(yáng)性或陰性患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性情況。③HCV基因分型測(cè)定。采用測(cè)序法測(cè)定HCV基因分型，提取HCV RNA，試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，行HCV Core/E1熒光定量PCR擴(kuò)增，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，采用MJ Reasearch公司PTC-420型全自動(dòng)PCR擴(kuò)增儀，核酸測(cè)序以熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物，HCV基因分型采用MEGA5序列分析軟件及NCBI在線基因分型工具。④抗病毒治療。對(duì)基因1型患者采用聚乙二醇干擾素α-2a(瑞士 Roche Pharma (Schweiz) Ltd，國(guó)藥準(zhǔn)字S20120047)聯(lián)合利巴韋林(中國(guó)藥科大學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10970280)治療，聚乙二醇干擾素α-2a，皮下注射，180 μg，1次/周；利巴韋林，1000 mg/d，分2次口服，肝組織Ishak纖維化評(píng)分≤4分者，療程為12個(gè)月，并隨訪6個(gè)月；肝組織纖維化評(píng)分>4分者療程為18個(gè)月，隨訪6個(gè)月。非基因1型者皮下注射聚乙二醇干擾素α-2a，180 μg，1次/周；利巴韋林，800 mg/d，分2次口服，療程6個(gè)月，隨訪6個(gè)月。治療過(guò)程嚴(yán)密監(jiān)測(cè)血常規(guī)，酌情調(diào)整藥物劑量或停藥。

1.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)①肝組織病理炎癥壞死評(píng)分。參照Knodell HAI評(píng)分系統(tǒng)[5]，內(nèi)容包括匯管周圍壞死(10分)、肝小葉內(nèi)變性和灶狀壞死(4分)、匯管區(qū)炎癥(4分)，總分18分，評(píng)分越高，表示肝組織病理炎癥壞死程度越高。②肝纖維評(píng)分。參照Ishak評(píng)分[6]，共0～6分，表示無(wú)纖維化、某些區(qū)域纖維化、大部分匯管區(qū)纖維化擴(kuò)展、大部分匯管區(qū)橋樣纖維擴(kuò)展、明顯纖維化擴(kuò)展、明顯橋樣纖維化伴小結(jié)節(jié)、可能或肯定存在纖維化。分別于抗病毒治療前、末次隨訪進(jìn)行上述評(píng)分，評(píng)估抗病毒治療效果，并統(tǒng)計(jì)患者肝組織病毒學(xué)陰轉(zhuǎn)率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1抗-HCV陽(yáng)性或陰性患者肝組織HCVRNA陽(yáng)性率比較 46例患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性33例，陽(yáng)性率71.74%；抗-HCV陽(yáng)性41例(89.13%)，陰性5例(10.87%)?？?HCV陽(yáng)性患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性率為75.61%，抗-HCV陰性患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性率為40.00%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.787，P> 0.05)，見(jiàn)表1。

表1 抗-HCV陽(yáng)性或陰性患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.2肝組織HCVRNA陽(yáng)性患者HCV基因型分布33例肝組織HCV RNA陽(yáng)性患者中HCV基因型為1型者18例，(54.55%)，非1型15例(45.45%)，其中包括基因2型9例(27.27%)，基因3型6例(18.18%)。

2.3肝組織KnodellHAI評(píng)分、Ishak評(píng)分比較抗病毒治療前，患者肝組織Knodell HAI評(píng)分、Ishak評(píng)分處于較高水平，末次隨訪，患者肝組織Knodell HAI評(píng)分、Ishak評(píng)分均降低，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)表2。

表2 抗病毒治療前后患者肝組織Knodell HAI評(píng)分、Ishak評(píng)分比較(分)

2.4不同HCV基因型患者肝組織HCVRNA陰轉(zhuǎn)率比較非1型慢性HCV感染患者末次隨訪肝組織HCV RNA陰轉(zhuǎn)率高于1型慢性HCV感染患者(χ2=4.332，P< 0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同HCV基因型患者肝組織HCV RNA陰轉(zhuǎn)率比較[n(%)]

3 討論

丙型肝炎為HCV感染所致傳染病類型，以血液傳播為主要途徑，早期癥狀不典型，起病隱匿，易漏診，延誤治療，影響患者預(yù)后[7]。早期確診HCV感染，則可為丙型肝炎傳播控制奠定基礎(chǔ)。目前用于丙型肝炎HCV感染檢測(cè)的方式包括HCV抗體檢測(cè)、HCV RNA測(cè)定及HCV基因型測(cè)定[8]，其中抗HCV抗體檢測(cè)是最早用于HCV感染診斷的方式，其操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，但假陽(yáng)性率高，特異性低[9]。Bradshaw等[10]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，抗-HCV陰性丙型肝炎患者可在肝組織檢出HCV RNA復(fù)制，而血清學(xué)HCV RNA雖特異性較高，但受到免疫因素、肝硬化病情、血清內(nèi)HCV RNA低水平等影響，部分HCV感染患者血清核心抗原大部分被病毒包膜蛋白覆蓋，導(dǎo)致血清內(nèi)HCV RNA含量極低，且HCV屬單鏈RNA病毒，基因突變率高，變異性強(qiáng)，導(dǎo)致HCV核心抗原無(wú)法特異性擴(kuò)增靶物質(zhì)，無(wú)法放大檢測(cè)信號(hào)，引起漏診[11，12]。且HCV急性感染伴免疫缺陷患者，HCV感染后抗體出現(xiàn)時(shí)間晚，濃度低，無(wú)法篩出HCV RNA。朱慶峰等[13]報(bào)道，部分原因未明持續(xù)性肝功能異常慢性肝病患者血清HCV RNA陰性者肝組織存在HCV RNA病毒復(fù)制。HCV屬黃病毒科，為嗜肝型病毒，HCV感染后HCV先經(jīng)肝細(xì)胞膜釋放，隨后進(jìn)入血液系統(tǒng)，并在外周血中檢出HCV RNA[14]，因此認(rèn)為，肝組織HCV RNA病毒學(xué)變化可能先于血清學(xué)改變[15，16]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，46例患者HCV RNA陰性患者肝組織HCV RNA陽(yáng)性33例，陽(yáng)性率為71.74%，表明血清HCV RNA檢測(cè)無(wú)法完全替代肝組織病理活檢。同時(shí)對(duì)抗-HCV陽(yáng)性及陰性患者肝組織HCV RNA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗-HCV陰性患者仍有一定比例的肝組織HCV RNA陽(yáng)性率，與常靜霞等[17]報(bào)道結(jié)論相似，提示常規(guī)抗-HCV檢測(cè)對(duì)HCV感染存在一定的局限性，即便抗-HCV陰性的患者亦無(wú)法完全排除HCV感染，因此對(duì)有明顯肝功能損傷但抗-HCV陰性者需進(jìn)一步行經(jīng)皮穿刺肝組織活檢，盡早確診丙型感染，為患者臨床治療提供指導(dǎo)。同時(shí)本研究對(duì)所有肝組織病毒學(xué)確診為HCV RNA陽(yáng)性患者進(jìn)行抗病毒治療，并根據(jù)患者不同基因分型采用不用劑量藥物干預(yù)，結(jié)果顯示，末次隨訪所有患者肝組織病理炎癥壞死評(píng)分、肝纖維化評(píng)分均顯著降低，且非1型HCV感染患者末次隨訪病毒學(xué)陰轉(zhuǎn)率較高，達(dá)80.00%，與王江南等[18]報(bào)道的76.7%相似，肯定了肝組織病理學(xué)檢測(cè)對(duì)慢性HCV感染抗病毒治療的指導(dǎo)價(jià)值。

綜上所述，對(duì)血清HCV RNA陰性、抗-HCV陰性且原因不明反復(fù)肝功能異常患者，建議行經(jīng)皮穿刺肝組織活檢，對(duì)肝組織炎癥壞死程度及纖維化程度進(jìn)行評(píng)估，并行肝組織HCV RNA定量測(cè)定，對(duì)肝組織HCV RNA陽(yáng)性者予抗病毒治療，可延緩患者病情進(jìn)展，提高HCV RNA陰轉(zhuǎn)率，有助于改善患者預(yù)后。