肝再生增強(qiáng)因子與大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性分析

龍飛伍，李世紅，劉 展，李云濤，劉雁軍，侯 康，張 抒

(成都市第三人民醫(yī)院普通外科，四川 成都 610031)

肝臟移植作為終末期肝病的唯一治療手段，近年來(lái)發(fā)展迅速，然而免疫抑制劑價(jià)格昂貴且長(zhǎng)期服用免疫抑制劑可能帶來(lái)的各種毒副作用嚴(yán)重影響肝移植的發(fā)展，同時(shí)已經(jīng)實(shí)施肝移植手術(shù)的患者術(shù)后慢性排斥反應(yīng)也逐年增加。所以，在研究中揭示肝移植免疫及急性排斥反應(yīng)機(jī)制及其調(diào)控方法，研究高效能、無(wú)毒性的免疫抑制劑是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration，ALR)是從初生大鼠肝組織提取出來(lái)的蛋白質(zhì)，能夠特異性促進(jìn)肝切除后肝組織再生及肝細(xì)胞增殖[1]，在急性及慢性肝炎、肝硬化患者肝組織中均能夠檢測(cè)到ALR表達(dá)增加[2]。外源性給予重組人ALR(Recombination human augmenter of liver regeneration，rhALR)能夠保護(hù)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化、肝硬化及藥物性肝損傷[3～5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)肝臟自然殺傷細(xì)胞(Nature kill cell，NK cell)的活性被ALR所抑制，減少產(chǎn)生及分泌INF-γ，顯現(xiàn)出ALR調(diào)控免疫活性的特性[2，6，7]。最新的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞活化及增殖也被ALR的活性所抑制，繼而減少I(mǎi)L-2合成及分泌，這一結(jié)果直接表明ALR免疫調(diào)控的能力及作用方式[8，9]。作為內(nèi)生性的肝臟免疫及營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)有的研究結(jié)果尚未揭示肝移植免疫調(diào)節(jié)中是否有ALR參與及其機(jī)制，值得我們進(jìn)一步的探討。

本研究成功建立了同種同基因及同種異基因大鼠肝移植動(dòng)物模型，觀察肝臟移植后大鼠的肝功能變化和移植物組織中INF-γ、IL-2和ALR的表達(dá)，嘗試在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中探討大鼠肝移植后移植物急性排斥反應(yīng)過(guò)程中ALR與INF-γ之間及ALR與IL-2之間表達(dá)變化趨勢(shì)的相關(guān)關(guān)系，探討肝移植后移植物急性排斥反應(yīng)中ALR可能的生物學(xué)作用及具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料本研究自2009年3月至2012年6月，ALR兔抗大鼠單克隆抗體由重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病毒性肝炎研究所贈(zèng)送；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega中國(guó)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit購(gòu)自大連TaKaRa公司；羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；大鼠IL-2及INF-γ 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美(深圳)生物科技有限公司；RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF購(gòu)自碧云天(上海)生物技術(shù)有限公司；其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑均定購(gòu)于相應(yīng)的試劑公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組采用改良的Kamada[10，11]“二袖套法”進(jìn)行大鼠原位肝移植。LEW和BN大鼠購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。術(shù)前禁食12小時(shí)，禁水6小時(shí)，采用乙醚吸入麻醉，建立急性排斥大鼠肝移植動(dòng)物模型組(急性排斥組，LEW到BN) 12只及免疫耐受大鼠肝移植動(dòng)物模型組(免疫耐受組，BN到BN) 12只。術(shù)后第1、3、5和7天兩大鼠各組隨機(jī)處死3只，取血漿-70 ℃冰箱保存，肝臟組織液氮迅速冷凍后保存于-150 ℃冰箱備用。

1.3肝功能檢測(cè)兩組大鼠肝移植后外周血漿中TBIL、ALT及AST采用全自動(dòng)生化分析儀(BeckmanCX7)自動(dòng)檢測(cè)。

1.4Real-timePCR檢測(cè)肝臟移植物組織內(nèi)ALR、INF-γ及IL-2mRNA的表達(dá)按Promega公司SV Total RNA Isolation System提取試劑盒的操作說(shuō)明完成肝臟移植物總RNA抽提。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)操作說(shuō)明完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)合成cDNA鏈。ALR(5’-AGCTGGATATGGCGCACATCA-3’，5’-AATTCAGGCATGCCCACCTTC-3’)；INF-γ (5’-ACGCCATCACCAACAAGATAAGTA-3’，5’-CACAGCT TAGTGCAGGATCTCTG-3’)；IL-2 (5’-AACGCTGGA ATTTTCATCTGCA-3’，5’-GCACATCATCGTATTGGCT CTC-3’) ；β-actin(5’-GCAGATTACAGCCCTGGGTCCTA-3’，5’-GTCTCATCGTAGTCCTGCTAGCTG-3’)，由TaKaRa公司(大連)完成引物設(shè)計(jì)及合成。按TaKaRa大連公司Realtime PCR試劑盒操作說(shuō)明(25 μl體系)完成定量PCR反應(yīng)。所有讀數(shù)均以β-actin值進(jìn)行校正后用2-ΔΔCT值表示[12]。

1.5ELISA檢測(cè)肝臟組織內(nèi)INF-γ和IL-2含量取-150 ℃保存的肝臟組織約500 mg移入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷PBS(0.02 mol/L，pH 7.0～7.2)3 ml于冰浴下反復(fù)研磨，勻漿液移入EP管中于冰浴下超聲破碎進(jìn)一步處理，5000轉(zhuǎn)離心5分鐘，留取上清備用。按大鼠INF-γ及IL-2 ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明完成肝臟組織內(nèi)INF-γ及IL-2檢測(cè)。

1.6Westernblotting檢測(cè)肝臟組織內(nèi)ALR蛋白的表達(dá)采用RIPA裂解液及PMSF提取肝臟組織總蛋白。Thermo BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)各樣本蛋白濃度，根據(jù)最終計(jì)算的上樣量加入5×Loading Buffer，100 ℃水浴5 min變性蛋白質(zhì)，自然冷卻后分裝，-80 ℃保存。按Western blotting操作流程制備12%分離膠，4%濃縮膠，根據(jù)計(jì)算好的各樣品上樣量上樣，每孔50 μg，(空余的孔加入10 μl 1×Loading Buffer)。選擇恒定電壓下電泳，濃縮膠40 V，分離膠80 V。恒定電流300 mA完成轉(zhuǎn)膜。TBST配制的5%脫脂牛奶封閉后加入稀釋好的ALR抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次后按1∶5000加入二抗，室溫下孵育1 h。TBST洗滌3次后采用ECL試劑盒顯影，采集圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，ALR和INF-γ以及ALR和IL-2蛋白表達(dá)變化的相關(guān)性應(yīng)用Pearson相關(guān)分析完成，并用線性回歸分析得出回歸方程。P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠肝移植后肝功能變化兩組肝移植術(shù)后第1天ALT、AST和TBIL比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。急性排斥組術(shù)后第3、5、7天ALT、AST和TBIL高于術(shù)后第1天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而免疫耐受組上述各項(xiàng)指標(biāo)在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第3、5、7天兩組間比較，急性排斥組ALT、AST、TBIL明顯高于免疫耐受組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肝移植后大鼠肝功能ALT、AST和TB水平變化

*組內(nèi)與術(shù)后第1天比較，P< 0.05；#與免疫耐受組比較，P< 0.05

2.2肝組織內(nèi)IL-2的表達(dá)兩組術(shù)后第1天IL-2 mRNA比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。急性排斥組術(shù)后第3、5、7天IL-2 mRNA表達(dá)明顯高于術(shù)后第1天，且明顯高于免疫耐受組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。肝臟組織內(nèi)IL-2表達(dá)與IL-2 mRNA一致。

2.3肝組織內(nèi)ALR的表達(dá)術(shù)后第1天兩組ALR mRNA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3、5、7天急性排斥組及免疫耐受組ALR表達(dá)均高于術(shù)后第1天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。術(shù)后第3天兩組ALR mRNA表達(dá)均明顯低于術(shù)后第1天，且免疫耐受組明顯高于急性排斥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。術(shù)后第5、7天免疫耐受組 ALR mRNA表達(dá)明顯高于急性排斥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。術(shù)后第5、7天急性排斥組ALR蛋白表達(dá)明顯低于免疫耐受組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見(jiàn)表2。

表2 移植肝臟組織內(nèi)INF-γ、IL-2與ALR表達(dá)

*與術(shù)后第1天比較，P< 0.05；★與術(shù)后第3天比較，P< 0.05；#與免疫耐受組比較，P< 0.05

2.4肝組織內(nèi)INF-γ的表達(dá)術(shù)后第1天急性排斥組肝臟組織內(nèi)INF-γ mRNA表達(dá)明顯高于免疫耐受組，且急性排斥組術(shù)后第3天明顯高于第1、5、7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫耐受組各時(shí)間點(diǎn)之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肝臟組織內(nèi)INF-γ表達(dá)與INF-γ mRNA一致。

2.5ALR表達(dá)與急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性分析大鼠肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)同種異基因組ALR與INF-γ 表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.6833，P< 0.05，y=-223.99x+545.15，圖1a)，而與IL-2的表達(dá)無(wú)顯著的相關(guān)性 (r=0.3775，P> 0.05，圖1b)。

圖1 ALR與INF-γ和IL-2表達(dá)相關(guān)曲線

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Hagiya等研究者[1]1994年在胎兒大鼠來(lái)源的肝臟組織中首次分離出能特異性的促進(jìn)部分肝切除后肝臟組織及肝細(xì)胞再生的生長(zhǎng)因子，稱為肝再生增強(qiáng)因子。其實(shí)質(zhì)上是一種能夠催化蛋白質(zhì)間二硫鍵形成的連接了黃素腺嘌呤核苷酸的巰基氧化酶(FAD-linked sulfdryl oxidase)[13]。

后來(lái)的研究在肝臟及睪丸組織發(fā)現(xiàn)ALR高表達(dá)，同時(shí)肝臟和睪丸組織是公認(rèn)的免疫特惠器官。肝臟或者睪丸與其他器官或組織聯(lián)合移植，可以誘導(dǎo)相關(guān)目標(biāo)移植物表現(xiàn)出免疫耐受，目標(biāo)移植物生存時(shí)間得以延長(zhǎng)[14～16]。研究發(fā)現(xiàn)ALR能夠在實(shí)驗(yàn)中抑制NK細(xì)胞活性，減少I(mǎi)FN-γ的表達(dá)及分泌[2]。肝臟干細(xì)胞移植后ALR能夠抑制其免疫排斥反應(yīng)，在體外研究中效果優(yōu)于環(huán)孢素A；肝臟干細(xì)胞移植聯(lián)合ALR治療急性肝衰竭，治療效果比單純干細(xì)胞治療得到明顯提高。體外研究結(jié)果證實(shí)，ConA誘導(dǎo)的脾臟單核細(xì)胞增殖及活化被ALR抑制，其合成及分泌IL-2明顯減少；因此有學(xué)者認(rèn)為認(rèn)為ALR本身具有免疫抑制能力[8，9]。潘桃等[17]的研究發(fā)現(xiàn)hALR能夠通過(guò)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)TGF-1及IL-10的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

我們?cè)谘芯拷Y(jié)果中發(fā)現(xiàn)無(wú)免疫抑制劑干預(yù)的條件下我們觀察到急性排斥組大鼠術(shù)后第1天IFN-γ的表達(dá)明顯升高，最高峰值在術(shù)后第3天出現(xiàn)，在術(shù)后第5、7天開(kāi)始出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；免疫耐受組肝移植術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IFN-γ表達(dá)均顯著低于急性排斥組，數(shù)據(jù)在較低水平波動(dòng)。Liang等[18]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠肝移植后ALR與IFN-γ mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但ALR在肝臟組織內(nèi)廣泛表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄水平的變化不能準(zhǔn)確反映ALR蛋白的功能狀態(tài)，因此我們?cè)谘芯恐袕牡鞍踪|(zhì)水平探討了ALR與IFN-γ及IL-2表達(dá)的相關(guān)性。我們的研究結(jié)果與Hideaki[19]的研究結(jié)果一致，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)同種異基因移植組移植肝臟組織內(nèi)IFN-γ與ALR蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)，我們推測(cè)ALR可能通過(guò)參與調(diào)節(jié)IFN-γ表達(dá)而影響急性排斥反應(yīng)。

Oliveira等[20]研究了腎移植后腎臟組織活檢提取的原代細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)22例患者出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)時(shí)血清中IL-2含量明顯升高，而在病情穩(wěn)定的21例患者血清中僅檢測(cè)到少量IL-2表達(dá)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)急性排斥組肝移植術(shù)后第3天開(kāi)始外周血中能夠檢測(cè)到IL-2表達(dá)增加，而且進(jìn)行性表現(xiàn)為逐漸增高的趨勢(shì)；而免疫耐受組肝移植術(shù)后IL-2的表達(dá)在不同的時(shí)間無(wú)顯著差異。相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALR與IL-2的表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Chen等[21]在研究中觀察到在大鼠肝移植后立即給予rhALR移植肝臟組織病理改變明顯減輕，移植物組織內(nèi)IFN-γ與IL-2的表達(dá)明顯下降，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡，而Xie[8]等在體外研究中的研究結(jié)果與此相同。我們的在研究中發(fā)現(xiàn)ALR與IL-2蛋白表達(dá)不相關(guān)，可能與同種異基因移植組肝移植后急性排斥反應(yīng)過(guò)程未被干預(yù)，ALR表達(dá)被影響有關(guān)；也可能與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控影響了急性排斥反應(yīng)的過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，我們?cè)谖唇o予外源性免疫抑制藥物干預(yù)的情況下通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了肝移植后移植肝臟內(nèi)ALR與IL-2及ALR與IFN-γ在發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)的表達(dá)變化關(guān)系。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)大鼠肝移植后急性免疫排斥反應(yīng)過(guò)程可能受到ALR的調(diào)控，而具體機(jī)制可能是ALR通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞合成及分泌細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)，Wang等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)肝臟kupffer細(xì)胞表面廣泛分布著ALR受體，kupffer細(xì)胞合成及分泌免疫細(xì)胞因子受到ALR調(diào)控。因此，我們?cè)谶@里推測(cè)ALR能夠抑制肝臟移植物急性免疫排斥反應(yīng)，其具體機(jī)制可能是ALR結(jié)合到KCs細(xì)胞膜上的受體，調(diào)控KCs合成及分泌免疫活性細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)Th活性，最后實(shí)現(xiàn)調(diào)控肝細(xì)胞增殖及細(xì)胞免疫作用。