逆轉(zhuǎn)素對肝星狀細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制

麥振豪，黃迪,2，翁杰鋒,2，黃子圣，黃宇，張漢意，張帥,2，古維立,2

(1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣州510180；2華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

肝纖維化是多種病因?qū)е碌囊环N慢性肝臟病理改變，炎癥反應(yīng)可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞激活導(dǎo)致肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加是肝纖維化發(fā)生的主要原因，而肝臟炎癥的存在可以直接或間接刺激星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)肝纖維化形成[2]。多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、轉(zhuǎn)錄生長因子β(TGF-β)等均可誘導(dǎo)HSC活化[3]。逆轉(zhuǎn)素(Reversine)是一種人工合成的小分子嘌呤衍生物，可使已分化的細(xì)胞重新具有多向分化的潛能[4]。本課題組前期研究證實(shí)，Reversine能促進(jìn)HSC凋亡，并可抑制星狀細(xì)胞中TGF-β1通路的激活[5]，但Reversine與肝臟炎癥反應(yīng)的關(guān)系尚未明確。2017年5～7月，本研究觀察了Reversine干預(yù)對星狀細(xì)胞TNF-α、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65(RELA)、IL-6、IL-17A mRNA表達(dá)的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果，探討Reversine在肝纖維化炎癥反應(yīng)過程中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細(xì)胞購自廣州中山大學(xué)細(xì)胞庫；Reversine購自Sigma Aldrich公司； Recombinant Human TNF-α購自PeproTech公司；重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白(rhTNFR，TNF-α抑制劑)購自三生國健藥業(yè)(上海)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將肝星狀細(xì)胞接種于含有100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)；置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%左右融合時(shí)進(jìn)行傳代并隨機(jī)分為五組。對照組常規(guī)培養(yǎng)，低濃度Reversine組加入終濃度為5 μg/mL的Reversine培養(yǎng)，高濃度Reversine組加入終濃度為10 μg/mL的Reversine培養(yǎng)，TNF-α組加入終濃度為0.05 μg/mL的TNF-α培養(yǎng)，rhTNFR組加入終濃度為10 μg/mL的Reversine及終濃度為0.5 mg/mL的rhTNFR培養(yǎng)。各組均培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 各組于藥物干預(yù)后在Olympus IX51倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.4 細(xì)胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。采用TRIzol法分別提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA轉(zhuǎn)錄為 cDNA，引物設(shè)計(jì)與合成均由廣州市銳博生物科技有限公司完成。在PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，測定靶基因的表達(dá)量。檢測條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，61 ℃、30 s，70 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對所有樣品進(jìn)行規(guī)一化處理，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)變化 對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，貼壁牢，細(xì)胞間連接緊密，胞體呈梭形或形態(tài)不規(guī)則，具有樹突狀突起，邊界清，大小均勻；Reversine組細(xì)胞間連接減少，出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，形成扁而大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，上述細(xì)胞形態(tài)改變在高濃度Reversine組更明顯；TNF-α組細(xì)胞亦出現(xiàn)皺縮、變圓等類似高濃度Reversine組的形態(tài)改變；rhTNFR組上述細(xì)胞形態(tài)改變程度小于Reversine組及TNF-α組。

2.2 各組細(xì)胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度Reversine組比較，△P<0.05；與高濃度Reversine組比較，#P<0.05；與TNF-α組比較，▲P<0.05。

3 討論

正常肝臟在一些致病因子的長期作用下會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，使肝細(xì)胞死亡，而肝細(xì)胞死亡又可以加重炎癥反應(yīng)程度，兩者相互作用共同促進(jìn)纖維化的發(fā)生。當(dāng)致病因子消除或者人為干預(yù)后，肝纖維化可得到逆轉(zhuǎn)，逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵靶細(xì)胞是星狀細(xì)胞[6]。Reversine是一種小分子藥物，其分子結(jié)構(gòu)式為C21H27N7O。Reversine可使定向細(xì)胞系去分化為未分化的具有多種潛能的干細(xì)胞，這些干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可再次分化為不同種類細(xì)胞。Shan等[7]發(fā)現(xiàn)Reversine可通過抑制肌源性轉(zhuǎn)錄蛋白desmin和myogenin表達(dá)進(jìn)而抑制星狀細(xì)胞生長，還可促進(jìn)Ezh2和PHC1蛋白表達(dá)使細(xì)胞重新編程。

TNF-α是目前公認(rèn)的強(qiáng)大的促炎癥細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞譜系的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生，通過介導(dǎo)1型和2型TNF受體發(fā)揮促炎作用，在多種慢性炎癥疾病的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。有研究表明，TNF-α可通過c-Jun途徑誘導(dǎo)促纖維化因子的表達(dá)，且可激活Kupffer細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)星狀細(xì)胞活化，刺激星狀細(xì)胞合成膠原，誘導(dǎo)纖維化形成；還可增強(qiáng)TGF-β對星狀細(xì)胞的增殖和刺激膠原合成的作用[9]。本研究結(jié)果顯示，Reversine組、TNF-α組、rhTNFR組干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生炎性改變，且高濃度Reversine組、TNF-α組更顯著，提示Reversine可導(dǎo)致星狀細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。

IL-6是一種主要由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，是肝臟炎癥和急性反應(yīng)階段的重要炎癥介質(zhì)，可直接通過MAPK或JAK/STAT信號通路激活肝星狀細(xì)胞[10]。Gajalakshmi等[11]發(fā)現(xiàn)，鼠肝臟來源的BMOL細(xì)胞分泌的IL-6可以通過NF-κB-iNOS-NO-ROS信號通路使活化的星狀細(xì)胞凋亡，有潛在的預(yù)防肝纖維化發(fā)生的功能。亦有研究報(bào)道，IL-6雖然是重要的促炎因子，但在正常生理?xiàng)l件下是必不可少的，其通過選擇性地介導(dǎo)信號通路抑制多種慢性肝臟病變的發(fā)生[12]。提示IL-6在肝纖維化炎癥過程中發(fā)揮雙重作用。

IL-17A的作用主要是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程，亦可刺激α-SMA、TGF-β、TNF-α等表達(dá)，特別是對TGF-β/SMAD信號通路，IL-17A可上調(diào)TGF-β-RⅡ進(jìn)而促進(jìn)星狀細(xì)胞活化，還可通過激活STAT3途徑促進(jìn)星狀細(xì)胞形成Ⅰ型膠原，促進(jìn)肝纖維形成[13,14]。Pu等[15]報(bào)道，IL-17A可激活ROS/p38通路進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)，參與肝纖維化的炎癥過程；IL-17A缺乏的肝纖維化小鼠其炎癥及纖維化程度均減輕；提示IL-17A在促炎和促纖維化方面均發(fā)揮重要作用[16]。

RELA是Rel/NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族最常見的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是誘導(dǎo)促炎癥基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。RELA廣泛存在于各種細(xì)胞中，可被各種刺激激活，與免疫應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)等關(guān)系密切[17]。RELA不但可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞等多種細(xì)胞的基本功能，也是炎癥過程中各種炎性基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其激活可同時(shí)促進(jìn)多種細(xì)胞因子如IL-1β、TGF-β1、TNF-α等表達(dá)。此外有研究發(fā)現(xiàn)，敲除RELA后星狀細(xì)胞凋亡增加，Ⅰ型膠原形成減少，說明RELA可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[18]。

本研究結(jié)果顯示，肝星狀細(xì)胞經(jīng)高濃度Reversine處理后TNF-α mRNA表達(dá)減少、 IL-6 mRNA表達(dá)增加；Reversine抑制TNF-α表達(dá)的效果弱于rhTNFR，提示Reversine可能不是通過TNF-α途徑發(fā)揮作用，其可能通過作用于IL-6發(fā)揮作用。TNF-α明顯刺激IL-17A mRNA表達(dá)，高濃度Reversine處理后IL-17A mRNA表達(dá)明顯受到抑制，且其抑制效果比rhTNFR更強(qiáng)。Reversine抑制IL-17A表達(dá)的能力強(qiáng)于rhTNFR。Reversine有可能通過抑制星狀細(xì)胞 IL-17A表達(dá)發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用。本研究中各Reversine干預(yù)組RELA mRNA表達(dá)無明顯變化，提示Reversine對RELA的調(diào)節(jié)作用不明顯。IL-6表達(dá)增加可通過NF-κB-iNOS-NO-ROS通路促進(jìn)星狀細(xì)胞凋亡。但本研究各組干預(yù)前后RELA表達(dá)無明顯變化，說明Reversine不能刺激NF-κB表達(dá)，其通過IL-6途徑促進(jìn)星狀細(xì)胞凋亡的可能性不大，但由于IL-6是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，所以Reversine更有可能是通過直接促進(jìn)IL-6表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)節(jié)其他炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。Reversine抑制IL-17A的表達(dá)，可能是通過抑制肝星狀細(xì)胞激活發(fā)揮作用，還可進(jìn)一步抑制α-SMA、TGF-β等促纖維化蛋白表達(dá)，使膠原纖維沉積減少。

綜上所述，Reversine可抑制肝星狀細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；抑制IL-17A表達(dá)、促進(jìn)IL-6表達(dá)可能是其作用機(jī)制。