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    萋-尼氏抗酸染色法和金胺O熒光染色法在結(jié)核分枝桿菌痰涂片檢測中的對比

    2018-07-20 06:51:04王春花王志銳巨韓芳
    天津醫(yī)科大學學報 2018年4期
    關鍵詞:染色法抗酸涂片

    趙 慧 ,王春花 ,孫 蕊 ,謝 彤 ,穆 成 ,王志銳 ,巨韓芳 ,朱 澤

    (1.天津醫(yī)科大學病原生物學系,天津300070;2.天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核參比室,天津300041)

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病,我國是全球高負擔國家之一[1]。結(jié)核病的診斷與防治一直是我國結(jié)核病控制工作面臨的重點。早期快速診斷對于結(jié)核病的治療和預防控制起著重要的作用。結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)實驗耗時較長,使用固體改良羅氏培養(yǎng)基(Lowenstein-Jensen,L-J)培養(yǎng)常常需要20 d~2個月,即使采用較先進的全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)做液體培養(yǎng)也需要7~20 d左右。實驗室最常用的方法是痰標本直接涂片法,此法操作簡單、價格低廉,但是操作起來比較費時,而基層痰檢實驗室在涂片量大的情況下1 d之內(nèi)無法得出結(jié)果,這樣的現(xiàn)狀遠遠不能滿足結(jié)核病臨床和防治工作的需要。近年來,熒光染色技術得到了飛速發(fā)展,作為一種研究方法或?qū)嶒炇侄?,已被廣泛地應用于醫(yī)學科學領域內(nèi)各種基礎理論研究和臨床診斷。目前,金胺O熒光染色也逐漸應用在結(jié)核分枝桿菌的痰涂片檢測上。本文對傳統(tǒng)的萋-尼氏抗酸染色法(簡稱Z-N)和熒光染色兩種染色方法在結(jié)核分枝桿菌痰涂片鏡檢過程中的檢測效能進行了初步的比較分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 標本來源 580例標本均來自于2012年8-12月天津市結(jié)核病控制中心門診部收取的病人送檢痰液。

    1.1.2 試劑和儀器 抗酸染色試劑盒和金胺O染色試劑盒,購自珠海貝索生物技術有限公司,LED熒光顯微鏡(carl ZEISS Primo Star iLED),圖像采集系統(tǒng)(ZEN.exe 1.0.1.0),Milli-Q Integral 3(A 10),NUAIR classⅡ生物安全柜(MODEL NO.NU-425-600E),BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson&Company)。

    1.2 方法

    1.2.1 標本的確認 痰標本排除口水痰后納入研究范圍。確認納入的當天,每份痰標本取相同位置痰液制成兩張涂片。

    1.2.2 涂片染色鏡檢 每份痰樣品各涂片2張,分別進行Z-N和熒光染色。染色時,Z-N法復紅染色時采用加熱5 min,熒光染色采用金胺O冷染15~20 min。鏡檢時,Z-N法在1000×鏡下觀察,金胺O法在400×鏡下觀察。具體的方法及報告標準參見文獻[2]。

    1.3 陰性對照組實驗 用高壓滅菌后的磷酸鹽緩沖液(PBS pH=6.8)作為樣本,制作60張涂片,30張為一組,第一組采用Z-N法涂片,第二組采用熒光染色法涂片。

    1.4 分枝桿菌全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)培養(yǎng) 采用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)進行樣本培養(yǎng),實驗方法及結(jié)果判定參照文獻[2]。

    1.5 讀片時間統(tǒng)計 對納入的580張涂片進行讀片時間的記錄,統(tǒng)計兩種染色法對同一標本各自的讀片時間。

    1.6 質(zhì)量控制 所有參與研究的人員都是經(jīng)過統(tǒng)一培訓的實驗室技術人員。納入標本的涂片和鏡檢,均由同一名實驗人員完成。

    1.7 統(tǒng)計學處理 兩率之間的比較采用χ2檢驗,兩種方法讀片時間上的比較采用t檢驗,P<0.05即為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Z-N法和熒光染色法與培養(yǎng)結(jié)果的比較 580份痰標本抗酸染色法陽性檢出率為10.8%,熒光染色法陽性率為15.3%,兩種方法比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.118,P<0.05)(表 1,圖 1)。

    表1 Z-N法和熒光染色法與培養(yǎng)結(jié)果的比較Tab 1 ComparisonbetweenZ-Nandfluorescentstainingandculture

    圖1 兩種染色方法及培養(yǎng)陽性數(shù)的比較Fig 1 Comparison betweentwostainingmethodsandpositivenumber of culture

    2.2 不同檢測方法的結(jié)果分析 見表2、3。兩種染色方法的診斷符合率無統(tǒng)計學差異(χ2=1.917,P>0.05),見表4;Z-N正確診斷指數(shù)(即約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1)為0.398 7,熒光染色正確診斷指數(shù)為0.545 8。

    表2 Z-N法與培養(yǎng)的檢測結(jié)果分析(n)Tab 2 AnalysisoftheresultsofZ-Nandculture (n)

    表3 熒光染色法與培養(yǎng)的檢測結(jié)果分析(n)Tab 3 Analysisoftheresultsoffluorescentstainingandculture (n)

    表4 兩種染色方法檢測對比Tab 4 Comparisonbetweentwostainingmethods

    2.3 對每一例標本在兩種染色方法中進行分級比較 對每一級別的結(jié)果進行χ2檢驗,結(jié)果表明兩種染色方法在各陽性分級比較中沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。另外,在陰性對照組30例中,有1例在熒光染色時,20×物鏡下見到兩條疑似結(jié)核桿菌,在油鏡下確認為并非結(jié)核桿菌(表5、6)。

    表5 實驗組Z-N染色和熒光染色結(jié)果的分級比較[n(%)]Tab5 ClassificationcomparisonbetweenZ-Nandfluorescentstaining intheexperimentalgroup [n(%)]

    表6 陰性對照組Z-N染色和熒光染色的結(jié)果Tab 6 Results of Z-N and fluorescent staining in negative control group

    2.4 兩種方法讀片時間比較 觀察580張涂片,抗酸染色累計用時2 505 min,平均用時4.32 min/張;熒光染色累計用時1 220 min,平均用時2.10 min/張。兩種方法的時間用t檢驗,結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。可見,熒光染色法的效率遠遠高于抗酸染色法。見表7,圖2~9。

    表7 兩種染色方法的讀片時間分析Tab 7 Analysisofthereadingtimebythetwomethods

    圖2 熒光染色+(10×40)Fig 2 Fluorescent staining+(10×40)

    圖3 熒光染色++(10×40)Fig 3 Fluorescent staining++(10×40)

    圖4 熒光染色+++(10×40)Fig 4 Fluorescent staining+++(10×40)

    圖5 熒光染色++++(10×40)Fig 5 Fluorescent staining++++(10×40)

    圖6 抗酸染色+(10×100)Fig 6 Z-N+(10×100)

    圖7 抗酸染色++(10×100)Fig 7 Z-N++(10×100)

    圖8 抗酸染色+++(10×100)Fig 8 Z-N+++(10×100)

    圖9 抗酸染色++++(10×100)Fig 9 Z-N++++(10×100)

    3 討論

    隨著實驗室診斷技術的進步,分子檢測技術被更多地運用到痰標本檢測中。其中多色巢式熒光定量PCR(Xpert MTB/RIF)無論在靈敏度還是特異度方面都遠遠高于傳統(tǒng)的細菌學檢測[3],但是考慮到明顯的成本效益和普及程度,痰涂片鏡檢在國家結(jié)核病控制規(guī)劃中仍是最有效的病人發(fā)現(xiàn)方法,傳統(tǒng)的萋-尼氏染色鏡檢是目前國內(nèi)主要的鏡檢方式[4]。不論是從結(jié)核病控制、流行病學調(diào)查和研究,還是從臨床診療的角度看,分枝桿菌的分離培養(yǎng)都是結(jié)核病病原學診斷的“金標準”[2]。本次研究中,以分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為參照分析,熒光染色靈敏度(57.58%)高于Z-N靈敏度(41.67%),而兩種方法的特異度相差不大,診斷符合率也無統(tǒng)計學差異(χ2=1.917,P>0.05);在正確診斷指數(shù)(即約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1)方面,熒光染色(0.545 8)要高于Z-N(0.398 7),而約登指數(shù)越高,說明篩查實驗的效果越好,真實性越大。綜合多組實驗數(shù)據(jù),說明熒光染色法診斷效果優(yōu)于抗酸染色法。

    有文獻報道[5]熒光染色法檢測痰中結(jié)核桿菌的靈敏度高,特異性和準確率也比較高。也有報道稱[6],熒光染色法特異性與抗酸染色法相似,但敏感性平均要高10%,本次實驗結(jié)果與其相一致。也有報道[7]顯示,對于結(jié)果為1+的標本,兩種染色方法的檢出率差異有統(tǒng)計學意義,而對于結(jié)果為±,2+,3+,4+的標本,兩種方法的檢出率無明顯差異,表明兩者陽性率的差異主要體現(xiàn)在含菌量較少的痰液標本。本實驗與其研究并不一致,這可能與本次實驗標本收集時間短,數(shù)據(jù)少有關。

    在操作上,抗酸染色法較熒光染色法繁瑣,加熱時易產(chǎn)生氣溶膠。熒光染色鏡檢抗酸桿菌在暗色背景下會發(fā)出橙黃色熒光,醒目易發(fā)現(xiàn)。并且熒光染色在20×物鏡視野大,鏡檢速度快,而抗酸染色100×油鏡視野小,鏡檢速度較慢。鏡檢時間的分析顯示,鏡檢580份涂片,熒光染色法的鏡檢時間要遠遠低于抗酸染色法的鏡檢時間。這對工作效率的提高有著重要的意義。有資料表明,熒光染色的假陽性率可高達5.9%,本研究結(jié)果與之相近,在30例陰性對照標本中,其中有1例在熒光染色時,20×物鏡下見到兩條疑似結(jié)核桿菌,在油鏡下確認為并非結(jié)核桿菌。故對于菌量少的樣本,在高倍鏡下觀察仍為疑似者,要在油鏡下再次確認其形態(tài),方可得出結(jié)論。另外,實驗中造成假陽性可能原因為熒光染色鏡檢使用的放大倍數(shù)(400×)較Z-N法鏡檢(1 000×)低,所以在菌量少的情況下,加上雜質(zhì)也會有熒光顯色的干擾,鏡下對菌體形態(tài)不容易辨認[8]。

    本研究結(jié)果表明,熒光染色鏡檢的敏感度比ZN法鏡檢提高15%多,特異度并沒有明顯降低;另外熒光染色鏡檢可以明顯縮短讀片時間,且染色無需加熱。所以使用熒光染色法鏡檢痰涂片,是一種快速、靈敏的檢測方法[9-11]。同時,該方法若配套圖像采集系統(tǒng),能更直觀的看到菌體情況,為臨床診斷和患者提供更快捷、更直接的報告方式。熒光染色法更適用于日工作量較大,并且人員鏡檢經(jīng)驗豐富的實驗室。

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