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    不同中藥對(duì)脂多糖刺激RIMVECs后PMNs殺菌酶釋放及內(nèi)源性 抗菌肽表達(dá)的影響

    2018-07-19 01:34高洋朱雯雨穆祥
    湖北畜牧獸醫(yī) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:中藥

    高洋 朱雯雨 穆祥

    摘要:為比較黃連、白頭翁、秦皮、黃柏和馬齒莧對(duì)脂多糖(LPS)刺激大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RIMVECs)后中性粒細(xì)胞(PMNs)釋放殺菌酶及內(nèi)源性抗菌肽(rCRAMP)表達(dá)的影響。建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系,試驗(yàn)分為L(zhǎng)PS對(duì)照組、LPS+黃連組、LPS+黃柏組、LPS+白頭翁組、LPS+秦皮組和LPS+馬齒莧組,運(yùn)用ELISA和Western Blotting(WB)較全面系統(tǒng)地研究了以上5種中藥對(duì)LPS刺激RIMVECs后PMNs殺菌酶釋放及rCRAMP表達(dá)的變化。當(dāng)LPS刺激RIMVECs后,與LPS對(duì)照組相比,LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs彈性蛋白酶(NE)分泌量顯著增加;LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs組織蛋白酶(CG)分泌量明顯增加,LPS+黃連和LPS+白頭翁組PMNs溶菌酶(LYS)分泌量極顯著增加,LPS+黃連組rCRAMP相對(duì)表達(dá)量顯著升高。結(jié)果表明,黃連和白頭翁明顯促進(jìn)LPS刺激RIMVECs后PMNs釋放殺菌酶和表達(dá)rCRAMP,對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。

    關(guān)鍵詞:中藥;脂多糖(LPS);殺菌酶;內(nèi)源性抗菌肽(rCRAMP)

    中圖分類號(hào):S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1007-273X(2018)05-0005-03

    近年來,隨著中藥國(guó)際化進(jìn)程的加快,中藥對(duì)于某些疾病良好的治療效果得到國(guó)際上廣泛認(rèn)可,并且在歐美國(guó)家出現(xiàn)“中藥熱”現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn),龍芩草因含黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸等對(duì)H1N1流感病毒有一定的抵抗作用[1];黃連、黃柏、白頭翁、秦皮及馬齒莧等中藥可提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能并能促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌[2-6],常用于治療或輔助治療感冒等疾病。中性粒細(xì)胞可分泌彈性蛋白酶(NE)和組織蛋白酶(CG)調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)[7,8],溶菌酶(LYS)和內(nèi)源性抗菌肽(rCRAMP)是天然的具有抗菌活性的蛋白質(zhì),中性粒細(xì)胞(PMNs)分泌LYS和rCRAMP是其能夠殺滅細(xì)菌的原因之一[9,10]。由于黃連、黃柏、白頭翁、秦皮及馬齒莧5味中藥對(duì)PMNs作用的影響未見詳細(xì)報(bào)道,故為探究以上5味中藥對(duì)脂多糖(LPS)刺激RIMVECs后PMNs釋放殺菌酶和表達(dá)rCRAMP的影響,本研究以RIMVECs和PMNs為研究對(duì)象,在成功建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系基礎(chǔ)上,運(yùn)用ELISA和Western Blotting(WB)試驗(yàn)方法,較系統(tǒng)地闡述以上5味中藥對(duì)PMNs在炎癥反應(yīng)中的影響,為黃連、白頭翁、秦皮等中藥在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用以及作為飼料添加劑等提供科學(xué)的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    SD大鼠,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。rCRAMP抗體,OmnimAbs公司;NE、CG和LYS檢測(cè)試劑盒,上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司;白頭翁、黃連、黃柏、秦皮和馬齒莧,北京同仁堂藥店。

    1.2 儀器設(shè)備

    CO2培養(yǎng)箱,SANYO公司;電泳儀,BIO-RAD公司等。

    1.3 方法

    1.3.1 黃連、白頭翁、黃柏、秦皮和馬齒莧的煎制處理 取以上5種中藥各50 g,分別放入藥罐中,加10倍體積去離子水浸泡30 min??旎鸢舅?,待水沸騰后,調(diào)慢火維持沸騰30 min,收集藥液,使用200目篩趁熱過濾。加入8倍體積去離子水煎煮1 h,收集藥液,趁熱過濾。加入4倍體積去離子水煮1 h,收集藥液,趁熱過濾。將3次收集的藥液合并過濾,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,將5種中藥水煎液的濃度濃縮至1 g/mL,于80 ℃真空干燥箱中干燥處理,冷卻后密封,于-20 ℃冰箱備用。

    1.3.2 分組及處理 參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的鼠RIMVECs-PMNs的Transwell體系[4],利用Transwell通透性支持物進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)體系中RIMVECs匯合至80%~90%時(shí),用D-hanks清洗2次,將細(xì)胞分為6組,即LPS對(duì)照組(LPS+DMEM)、LPS+黃連組(LPS+HL)、LPS+黃柏組(LPS+HB)、LPS+白頭翁組(LPS+BTW)、LPS+秦皮組(LPS+QP)、LPS+馬齒莧組(LPS+MCX)。分別加入1.5 mL 10 μg/mL的LPS預(yù)處理4 h,藥物組分別加入1.5 mL上述中藥(200 μg/mL黃連、200 μg/mL黃柏、100 μg/mL白頭翁、500 μg/mL秦皮和1 mg/mL馬齒莧,通過預(yù)試驗(yàn)獲得藥物安全濃度),LPS對(duì)照組加無血清的DMEM培養(yǎng)液,藥物組分別加入2.6 mL DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃的5%CO2中培養(yǎng)24 h。各組中加入提取好的PMNs(5×106個(gè)/mL),同時(shí)加入2.6 mL 2%1640培養(yǎng)基,孵育3 h后收集樣品并標(biāo)記。

    1.3.3 對(duì)PMNs遷移RIMVECs后釋放NE、CG和LYS的檢測(cè) 將細(xì)胞上清液以3 000 r/m離心10 min去除顆粒物,依據(jù)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行NE、CG和LYS檢測(cè),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算NE、CG和LYS分泌量。

    1.3.4 對(duì)PMNs遷移RIMVECs后rCRAMP的表達(dá) 提取細(xì)胞蛋白質(zhì),依據(jù)WB步驟檢測(cè)rCRAMP表達(dá)量,以目的蛋白質(zhì)與actin的灰度比值表示目的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

    1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P>0.05表示差異不顯著,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同中藥對(duì)跨內(nèi)皮細(xì)胞PMNs分泌NE、CG的影響

    當(dāng)LPS刺激RIMVECs后,依據(jù)不同中藥對(duì)RIMVECs遷移PMNs及正常未跨越RIMVECs的PMNs的NE和CG的分泌量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1、圖2),R2均大于0.95,根據(jù)試劑盒使用要求,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線均可用。與LPS+DMEM組相比,LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的NE分泌量顯著增加(P<0.05);與LPS+DMEM組相比,LPS+HL組PMNs的CG分泌量極顯著增加(P<0.01),LPS+BTW組CG釋放量顯著增高(P<0.05),其余中藥組沒有顯著變化(圖3、圖4)。

    2.2 不同中藥對(duì)跨內(nèi)皮細(xì)胞PMNs分泌溶菌酶的影響

    當(dāng)LPS刺激RIMVECs后,測(cè)定不同中藥對(duì)RIMVECs遷移PMNs及正常未跨越RIMVECs的LYS分泌量,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),依據(jù)試劑盒使用要求R2大于0.95,即繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。與LPS+DMEM組相比,LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的LYS分泌量極顯著增加(P<0.01);LPS+HB和LPS+QP組PMNs的LYS分泌量增加,但差異不顯著(P>0.05)(圖6)。

    2.3 不同中藥對(duì)PMNs跨內(nèi)皮后rCRAMP表達(dá)的影響

    當(dāng)LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后,LPS+HL組rCRAMP的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),LPS+BTW和LPS+QP組rCRAMP的相對(duì)表達(dá)量也增加,但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示在rCRAMP表達(dá)上,中藥黃連的保護(hù)作用更明顯(圖7、圖8)。

    3 討論

    NE是由PMNs分泌的炎癥介質(zhì),正常劑量NE可緩解感染對(duì)機(jī)體的損傷,但高劑量NE可降解膠原蛋白、層黏連蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì),并通過EGFR、p38MAPK、ERK等信號(hào)通路調(diào)節(jié)黏液蛋白的分泌[7]。CG是由PMNs和單核細(xì)胞分泌產(chǎn)生的絲氨酸亞型組織蛋白酶,其通過水解活化細(xì)胞因子調(diào)控炎癥。當(dāng)LPS刺激RIMVECs后,與LPS+DMEM組相比,LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的NE分泌量顯著增加(P<0.05);與LPS+DMEM相比,LPS+HL和,LPS+BTW組PMNs的CG分泌量極顯著或顯著增加(P<0.01,P<0.05),以上結(jié)果揭示黃連和白頭翁通過修復(fù)RIMVECs后,使得PMNs被激活釋放NE和CG,其作用機(jī)制可能為:黃連和黃柏含有豐富的黃連素、多糖等物質(zhì),而白頭翁含白頭翁素等有效成分,當(dāng)LPS+黃連或白頭翁等作用細(xì)胞后,黃連素和白頭翁素可能與RIMVECs表面的受體相互作用進(jìn)而激活胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路,被激活后的RIMVECs釋放大量趨化因子,如IL-18、IL-1和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等,這些物質(zhì)會(huì)刺激并激活PMNs,激活后的PMNs將胞內(nèi)顆粒釋放到胞外,后者含大量NE和CG,能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。

    LYS是一種天然抗菌蛋白,由PMNs等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生。主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有殺滅或抑制作用。rCRAMP是哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有抗菌作用的小分子多肽類物質(zhì),不同物種間內(nèi)源性抗菌肽具有功能上的高度保守,具有抑制細(xì)菌、真菌、病毒等作用,又能促進(jìn)趨化因子釋放,還可中和LPS并減輕內(nèi)毒素性休克。rCRAMP是大鼠中惟一的內(nèi)源性抗菌肽[9],通過檢測(cè)LYS分泌量和rCRAMP表達(dá)量可更好的評(píng)判PMNs跨內(nèi)皮細(xì)胞后的抑菌或殺菌功能。當(dāng)LPS刺激RIMVECs后,與LPS對(duì)照組相比,LPS+HL和LPS+BTW組PMNs的LYS分泌量極顯著增加(P<0.01),LPS+HL組rCRAMP的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),結(jié)果顯示,在rCRAMP表達(dá)水平上,黃連的抑菌殺菌作用最明顯。PMNs膜表面的整合素蛋白與RIMVECs膜表面的ICAM受體蛋白結(jié)合后,PMNs形態(tài)發(fā)生變化而穿過RIMVECs,PMNs吞噬LPS而被激活,釋放出LYS和rCRAMP,而黃連和白頭翁等中藥的有效成分進(jìn)一步促進(jìn)PMNs釋放出LYS和rCRAMP,所以表現(xiàn)出LPS+HL或BTW組PMNs釋放LYS和表達(dá)rCRAMP顯著增加。

    黃連、白頭翁、黃柏、秦皮和馬齒莧對(duì)LPS刺激RIMVECs后PMNs的NE、CG、LYS和rCRAMP表達(dá)均有不同程度的影響,其中黃連和白頭翁的促進(jìn)表達(dá)作用效果顯著,說明以上兩種中藥可通過顯著增加PMNs的溶菌酶釋放和抗菌肽表達(dá)來提升保護(hù)效果,本研究為以上5種中藥在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用和作為飼料添加劑提供了理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

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