自擬促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑對大鼠脊髓損傷后凋亡相關(guān)蛋白bcl-2，bax，Caspase-3表達(dá)的影響＊

祁　健，張俊江，趙廷寶

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）為脊柱骨折的最嚴(yán)重并發(fā)癥［1］，脊髓損傷后患者運(yùn)動(dòng)或感覺功能發(fā)生障礙給患者本人帶來了旁人難以理解的身心痛苦，給家庭及社會(huì)帶來巨大傷害及沉重負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響了家庭穩(wěn)定、社會(huì)和諧［2-5］。

脊髓損傷后的病理生理變化及損傷機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)過程［6-8］，目前已經(jīng)基本闡明的病理機(jī)制主要有兩種：包括機(jī)械性損傷導(dǎo)致的原發(fā)性損傷和血管、生化反應(yīng)所致的繼發(fā)性損傷［9-11］。原發(fā)性損傷為高能量暴力作用于脊柱脊髓瞬間所造成的物理性損傷，多為不可逆性損傷，容易造成神經(jīng)細(xì)胞的壞死，繼發(fā)性損傷是原發(fā)性損傷的延續(xù)和發(fā)展，是多種因素參與的瀑布式級聯(lián)放大反應(yīng)。目前認(rèn)為參與的機(jī)制有：血管機(jī)制、自由基學(xué)說、興奮性氨基酸學(xué)說、炎癥反應(yīng)、電解質(zhì)紊亂以及鈣離子超載等，一系列繼發(fā)性反應(yīng)引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［12］。如果在臨床中任其發(fā)展，對脊髓組織產(chǎn)生的損害甚至超過原發(fā)性損傷。所以針對繼發(fā)性損傷的機(jī)制研究及如何阻斷繼發(fā)性損傷的病理變化，是脊髓損傷治療的熱點(diǎn)。

促神經(jīng)再生注射劑（專利號：ZL201210115594.1，即N6復(fù)合制劑）是原濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院脊髓修復(fù)科根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的一種專利復(fù)合制劑。前期的研究已經(jīng)驗(yàn)證了N6在大鼠脊髓損傷模型中能抑制凋亡蛋白［13］，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了N6保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，避免其凋亡。該課題在前述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過復(fù)制大鼠脊髓損傷模型，在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射N6，觀察N6不同時(shí)間點(diǎn)對于神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的影響。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雄性成年SD大鼠，250～300 g，SPF級，由原濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號20140006。實(shí)驗(yàn)過程中每籠飼養(yǎng)不超過3只動(dòng)物，保持室內(nèi)恒溫（22～25℃）。為不干擾動(dòng)物晝夜生物節(jié)律，動(dòng)物室每日8：00～20：00開燈。實(shí)驗(yàn)預(yù)先得到濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的認(rèn)可。

脊髓撞擊器 （NYU/MASCIS Impactor modelⅡ）。 試劑：兔抗 bcl-2（1∶500，3498，cell Signal），兔抗 bax（1∶500，5032，Cell Signal），兔抗 Caspase-3（1∶500，9665，Cell Signal）及兔抗 actin（1∶500，BM0627，博士德），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG （1∶500，ZDR-5306，北京中杉）。 tunel試劑盒（全式金，F(xiàn)A201-01）。

1.2方法

1.2.1脊髓損傷大鼠模型的制備及評價(jià)統(tǒng)一采用由Allens創(chuàng)建的重物墜落法 （Weight dropping，WD 法）［10］經(jīng)由 NYU（NYU/MASCIS Impactor modelⅡ）脊髓撞擊器建立大鼠急性脊髓損傷模型。術(shù)后用 BBB 評分（Basso，Beattie&Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）評估SCI后后肢運(yùn)動(dòng)功能，以及曠場實(shí)驗(yàn)評估，將出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)距離降低的視為造模成功。

1.2.2分組將SD大鼠隨機(jī)分為3組，即對照組：脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)（8 h，16 h）內(nèi)注射生理鹽水，鞘內(nèi)注射。甲強(qiáng)龍組：脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)（8 h，16 h）注射甲強(qiáng)龍（30 mg/kg），鞘內(nèi)注射。N6 合劑組：脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)（8 h，16 h）注射 N6（25 μl），鞘內(nèi)注射。

1.2.3HE染色戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，之后用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）200 ml經(jīng)主動(dòng)脈沖洗血液。將含有多聚甲醛（2%）以及飽和苦味酸（75%）的500 ml，0.1 mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行固定。取腦組織，之后放入固定液中后固定4 h，將腦組織放入含有蔗糖（30%）的0.1 mol/L的磷酸緩沖液中，放入冰箱（4℃），待其沉底。進(jìn)行HE染色，具體步驟如下：（1）脫蠟至雙蒸水；（2）玻片放入蘇木素液 5 min，雙蒸水漂洗 1 min；（3）1%鹽酸乙醇溶液分化 20 s，雙蒸水漂洗 30 s；（4）0.6%氨水返藍(lán) 30 s， 水洗 30 s；（5）1%伊紅染色 3 min，水洗 30 s；（6）無水乙醇溶液脫水 3 次，5 min/次；（7）放入二甲苯透明 5 min；（8）用中性樹膠封片。光鏡下觀察脊髓切片的組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4TUNEL法計(jì)數(shù)脊髓凋亡細(xì)胞數(shù)灌注取材同上，具體步驟同下：（1）切片脫蠟至雙蒸水；（2）抗原修復(fù)：組織上滴加蛋白酶K工作液，放于濕盒內(nèi)，室溫下孵育15 min。（3）破膜：組織上滴加0.3%Triton X-100，常溫下孵育10 min。PBS洗滌3次，每次5 min；（4）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將切片置于3%H2O2溶液中，常溫避光孵育 20 min；（5）取 Tunel試劑盒試劑 1 （TdT）和試劑 2（dUTP）按 1∶9 的比例混合均勻，滴加到切片上，放入濕盒中，37℃水浴鍋孵育 60 min；（6）滴加試劑 3 （coverter-POD）于組織上，放于濕盒內(nèi)。放入37℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min；（7）DAB顯色：滴加DAB顯色液，鏡下觀察染色反應(yīng)，當(dāng)胞核呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，停止反應(yīng)，雙蒸水沖洗；（8）復(fù)染細(xì)胞核：蘇木素復(fù)染約3 min，1%鹽酸乙醇溶液進(jìn)行分化，0.6%氨水返藍(lán)約3 min；（9）脫水封片：切片依次在70%、80%、90%、95%乙醇溶液、無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ脫水至透明，中性樹膠封片；（10）光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照，每個(gè)玻片組織隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算均數(shù)，Image-Pro Plus6.0分析計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.2.5DAB顯色灌注取材同上，具體步驟同下：（1）3%H2O2封閉 10 min，羊血清封閉 30 min；一抗室溫下孵育 6～8 h，然后放到 4 ℃冰箱 3 d；（2）生物素化（biotin）的驢抗兔抗體（1∶200，Vector），室溫下孵育 4 h；（3）在 A 液 B 液（1∶200，Chemicon）中室溫下孵育2 h；（4）DAB溶液呈色，含有 DAB 0.04 g、Tris-HCl 10 ml、過氧化氫20μl。在DAB中呈色30 min后，切片變?yōu)闇\棕色。在顯微鏡下觀察，終止反應(yīng)。裱片，脫水透明?？贵w稀釋液為含5%山羊血清、0.3%Triton X-100、0.05% （w/v） 疊氮鈉的 PBS。觀察用數(shù)字照相機(jī)（VANOX；奧林巴斯，日本，東京）。

1.2.6Western Blot方法按照實(shí)驗(yàn)分組，取手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物，將大鼠快速取腦，冰上分離內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)，加入含有苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的單去污裂解液，勻漿裂解30 min，將勻漿裂解液移入1.5 ml離心管，于1200 r/min，4℃離心5 min，留取上清液，分裝于0.5 ml離心管，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，確定蛋白的上樣體積。蛋白樣品采用8%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，加入預(yù)染的Marker，根據(jù)預(yù)染Marker的位置確定所需蛋白bcl-2，bax，Caspase-3及actin的位置，將所需蛋白條帶剪下，然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上做免疫雜交反應(yīng)。用含5%BSA封閉2 h后，然后加入兔抗 bcl-2（1∶500，cell Signal），兔抗bax（1∶500，Cell Signal），兔抗 Caspase-3（1∶500，Cell Signal）及兔抗 actin（1∶500，博士德），4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶500，北京中杉），37℃孵育1 h，ECL曝光。PVDF膜常溫曬干后進(jìn)行條帶掃描并分析，對比灰度值，比較不同實(shí)驗(yàn)組蛋白的表達(dá)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，采用兩因素相應(yīng)析因設(shè)計(jì)對應(yīng)的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同組之間對比采用LSD-t檢驗(yàn)，取P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HE染色觀察脊髓損傷后組織的變化情況HE染色可觀察到脊髓組織結(jié)構(gòu)的完整性及炎癥細(xì)胞浸潤等情況。光鏡下可見脊髓損傷后8 h脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤明顯，部分視野空泡形成，無明顯神經(jīng)元細(xì)胞；脊髓損傷后8 h應(yīng)用N6合劑組脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂減輕，同樣有炎性細(xì)胞浸潤，可見殘存神經(jīng)元細(xì)胞（圖1），統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示與脊髓損傷后8 h應(yīng)用甲強(qiáng)龍組、脊髓損傷后16 h應(yīng)用N6合劑組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖 1　HE染色后不同組脊髓組織結(jié)構(gòu)及殘存神經(jīng)細(xì)胞

2.2TUNEL染色觀察脊髓損傷后給予不同藥物的細(xì)胞凋亡情況脊髓損傷后，給予不同藥物治療后，可見不同數(shù)量的胞核呈褐色的陽性凋亡細(xì)胞。脊髓損傷后8 h有大量胞核呈褐色的陽性細(xì)胞；脊髓損傷后8 h給予生理鹽水治療組，可見大量胞核呈褐色的陽性細(xì)胞；脊髓損傷后8 h給予N6治療組，可見數(shù)量不等的胞核呈褐色的陽性細(xì)胞（圖3）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，與脊髓損傷后16 h給予N6治療組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

2.3DAB染色觀察脊髓損傷后給予不同藥物后caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量caspase-3陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)褐色或黃褐色，胞核為藍(lán)色的細(xì)胞?？梢娂顾钃p傷后8 h有大量胞核呈褐色的陽性細(xì)胞；脊髓損傷后8 h給予生理鹽水治療組，可見大量胞核呈褐色的陽性細(xì)胞；脊髓損傷后8 h給予N6治療組，可見數(shù)量不等的胞核呈褐色的陽性細(xì)胞（圖5），與脊髓損傷后16 h給予N6治療組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 6）。

2.4Western-blotting檢測caspase-3，bax及bcl-2蛋白表達(dá)水平Western-blotting實(shí)驗(yàn)可以觀察到脊髓損傷后Caspase-3、bax蛋白表達(dá)增加，8 h給予N6后可以減少Caspase-3、bax蛋白的表達(dá)，與給予甲強(qiáng)龍組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與16 h給予N6相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖7～10）。觀察到脊髓損傷后bcl-2蛋白表達(dá)減少，8 h給予N6后可以增加bcl-2蛋白的表達(dá)，與給予甲強(qiáng)龍組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與16h給予N6相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖11、12）。

圖 2　HE染色后不同組殘存神經(jīng)細(xì)胞的比較

圖 3　Tunel染色后不同組脊髓組織結(jié)構(gòu)中的凋亡細(xì)胞

圖 4　Tunel染色后不同組凋亡細(xì)胞數(shù)量的比較

圖 5　DAB染色后不同組脊髓組織結(jié)構(gòu)中的caspase-3陽性細(xì)胞

圖 6　DAB染色后不同組caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量的比較

圖 7　分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測Caspase-3在各組大鼠的表達(dá)量

圖 8　Caspase-3在各組大鼠的表達(dá)量的比較

圖 9　分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測bax在各組大鼠的表達(dá)量

圖 10　bax在各組大鼠的表達(dá)量比較

圖 11　分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測Bcl-2在各組大鼠的表達(dá)量

圖 12　Bcl-2在各組大鼠的表達(dá)量比較

3　討論

該實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠急性脊髓損傷模型，檢測損傷后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化及計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，結(jié)果提示 N6復(fù)合劑在大鼠脊髓損傷后可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且N6復(fù)合劑的早期應(yīng)用更有利于大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)。

研究表明脊髓損傷后細(xì)胞分為壞死和凋亡［14，15］。壞死發(fā)生在機(jī)械性損傷后，為不可逆性，細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶水解周圍組織，引起細(xì)胞自溶，炎性細(xì)胞浸潤。凋亡為細(xì)胞程序性死亡，為機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境的刺激后，清除自身損傷細(xì)胞的過程。脊髓損傷后神經(jīng)元凋亡多發(fā)生在繼發(fā)損傷階段，在一定的外界因素干預(yù)下，可阻止凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)受損傷的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)脊髓康復(fù)。由于凋亡是一個(gè)多種活性因子參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，研究并發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是阻止細(xì)胞走向凋亡的基礎(chǔ)。

目前發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路主要有4條途徑：（1）死亡因子及其受體介導(dǎo)的外部傳導(dǎo)途徑［16］；（2）線粒體凋亡途徑（內(nèi)部信號傳導(dǎo)途徑）［17］；（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑；（4）B粒酶凋亡途徑。目前為止，細(xì)胞凋亡的確切分子機(jī)制還不清楚，但細(xì)胞凋亡涉及一系列胞質(zhì)內(nèi)凋亡蛋白的活化及底物的裂解，目前的研究熱點(diǎn)是Caspase蛋白家族及bcl-2蛋白家族。

Caspase蛋白家族現(xiàn)已有14個(gè)家族成員，激活的Caspase家族成員根據(jù)在凋亡過程中所發(fā)揮的作用分為不同種類：凋亡始動(dòng)組，凋亡效應(yīng)組，炎性反應(yīng)組［18］。其中凋亡效應(yīng)組的Caspase-3是凋亡過程中最為關(guān)鍵的酶，被稱為“死亡蛋白酶”，它的激活被看作是細(xì)胞進(jìn)入了不可逆凋亡階段的重要標(biāo)志。該實(shí)驗(yàn)觀察到脊髓損傷后Caspase-3表達(dá)增高，給予N6后能抑制其增高，表明N6對脊髓損傷修復(fù)有作用。

Bcl-2/bax蛋白家族成員同樣在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中扮演著重要的角色，它既可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，又可以阻止細(xì)胞走向凋亡［19］。通過家族成員之間不同比例及構(gòu)象的變化，發(fā)揮著對細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的雙重作用。目前為止，bcl-2蛋白家族可分為兩類：（1）抗凋亡亞族，它包括 bcl-2、A1、bcl-w、bcl-xl等；（2）促凋亡亞族，一類含有BH1-3三個(gè)結(jié)構(gòu)域的bax/bak/bok等，另一類含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bid/bad/bik等。在細(xì)胞正常狀態(tài)時(shí)，促凋亡蛋白多位于胞質(zhì)內(nèi)，并被抗凋亡蛋白所結(jié)合，處于無效狀態(tài)，在接收到胞內(nèi)凋亡信號后，唯BH-3蛋白與抗凋亡蛋白結(jié)合，進(jìn)而釋放促凋亡蛋白 BH1-3，如 bax、bak，這些被釋放并通過構(gòu)象變化活化的促凋亡蛋白，會(huì)通過C端特殊的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域插入到線粒體外膜上，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)，進(jìn)而引起細(xì)胞走向凋亡［20］。細(xì)胞凋亡途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中關(guān)鍵的蛋白酶為Caspase-3及bcl-2/bax，代表了細(xì)胞凋亡的兩個(gè)經(jīng)典途徑，該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的方法，觀察了脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)給予N6對Caspase-3及bcl-2/bax蛋白酶表達(dá)變化的影響。結(jié)果提示早期應(yīng)用N6可以減少Caspase-3及bax蛋白酶的表達(dá)，同時(shí)增加bcl-2的表達(dá)。該結(jié)果表明N6促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)，是阻止了細(xì)胞凋亡途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，主要是減少了促凋亡蛋白酶Caspase-3及bax的表達(dá)，同時(shí)增加了抗凋亡蛋白酶bcl-2的表達(dá)。