苦參堿與人血清白蛋白和牛血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究

楊美玲 崔東亞 王麗雪 張杰

摘要：在模擬生理pH條件下，采用熒光光譜法、紫外-可見吸收光譜法和圓二色譜法研究了苦參堿與人血清白蛋白（Human serum albumin，簡稱HSA）和牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，簡稱BSA）的相互作用。紫外吸收光譜法和熒光光譜法的試驗結(jié)果表明，苦參堿對HSA和BSA相互作用在基態(tài)時形成復(fù)合物，因此對HSA和BSA均具有一定的熒光猝滅作用，其猝滅方式為靜態(tài)猝滅，在22、27和37 ℃時其猝滅常數(shù)分別為HSA 3.07×104、1.71×104、4.60×103 L/mol和BSA 4.48×104、3.91×104和3.17×104 L/mol；結(jié)合常數(shù)分別為HSA 5.999×105、3.097×106、6.667×107 L/mol和1.007×105、1.163×105、1.582×105 L/mol；結(jié)合位點數(shù)基本維持不變。而圓二色譜法和熱力學(xué)參數(shù)的計算結(jié)果表明苦參堿與HSA及苦參堿與BSA兩者之間的作用力為疏水作用且為自發(fā)反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：苦參堿；人血清白蛋白（HAS）；牛血清白蛋白（BSA）；熒光光譜；紫外-可見光譜；圓二色譜

中圖分類號：S567.1+9；O657.7+3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0096-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.024

Abstract： The interaction between matrine （MAT） and human serum albumin （HSA） and bovine serum albumin （BSA） were investigated by fluorescence spectroscopy，UV absorption spectroscopy and circular dichroism spectroscopy with the simulated physiological condition. The experiment results of show UV absorption spectroscopy and fluorescence spectroscopy that matrine can react with HSA or BSA and form a kind of new compound at the ground state and prove that the flurescence quenching of HSA or BSA by matrine is dynamic quenching，and at different temperature，quenching constants are respectively HSA：4.60×103，1.71×104，3.07×104 L/mol and BSA：3.17×104、3.91×104 and 4.48×104 L/mol； binding constants are respectively HSA：5.999×105、3.097×106，6.667×107 L/mol and 1.007×105，1.163×105，1.582×105 L/mol， the number of binding sites is approximately equal to 1. The calculation results of thermodynamic parameters display that the reaction is hydrophobic effect and is spontaneous reaction between matrine and HSA or BSA.

Key words： matrine； HSA； BSA； fluorescence spectroscopy； UV absorption spectroscopy； circular dichroism spectroscopy

苦參堿（Matrine，簡寫MAT，分子結(jié)構(gòu)見圖1）是中國較為傳統(tǒng)的一種生物堿類中草藥，可以通過抑制酶的活性來抑制腫瘤細(xì)胞的增加，可以通過控制基因和端粒酶的活性來控制腫瘤細(xì)胞[1]，在抵抗腫瘤疾病方面具有明顯的效果。臨床應(yīng)用中，苦參堿主要用于清熱、抵抗HBV病毒、抗腫瘤、破壞結(jié)核桿菌的正常生長周期[2]，在體外能不同程度抑制導(dǎo)致皮膚病的真菌，具有抗癌、抗炎、抗心律失常及治療心律不齊等多方面的藥理活性，是近年來藥學(xué)領(lǐng)域研究開發(fā)的熱門課題之一。近幾年對苦參類生物堿在體內(nèi)體外的作用機理已經(jīng)取得了很大進展，一些有價值的功能有待深入研究，以更好地發(fā)揮其藥用價值。藥物在血液中通常以游離的形式存在，與血液中的血清白蛋白相結(jié)合達到動態(tài)平衡，再通過血清白蛋白運輸?shù)街付ǖ钠鞴?。因此，研究藥物與血清白蛋白之間的相互作用，有利于了解藥物在分子水平的機制，可以為藥物研究提供數(shù)據(jù)方面的指標(biāo)和藥物需要的參數(shù)[3，4]，對研究藥物的藥代動力學(xué)具有重要意義[5]。為了更好的了解苦參堿的藥理活性和藥代動力學(xué)，本研究主要采用紫外可見光譜法、熒光光譜法和圓二色譜法研究苦參堿與人血清白蛋白（Human serum albumin，簡稱HSA）和牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，簡稱BSA）的相互作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent-8453型紫外分光光度計，美國Agilent公司；LS-55型熒光分光光度計，美國PE公司。

人血清白蛋白和牛血清白蛋白購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苦參堿購于鄭州永和制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜法 在室溫下，取10 mL濃度為3×10-4mol/L的 HSA于25 mL的比色管中，用2.0×10-3 mol/L的苦參堿滴定，以pH 7.24的Tris-HCl緩沖溶液為參比，然后用1 cm的石英比色皿在250～450 nm內(nèi)掃描其紫外-可見吸收光譜。用同樣的方法測定BSA的紫外-可見吸收光譜。

1.2.2 熒光光譜法 在室溫下，量取10 mL濃度為3×10-6 mol/L的HSA于25 mL的比色管中，用微量進樣器加入定量2.0×10-3 mol/L的苦參堿溶液，以280 nm為激發(fā)波長，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm，用1 cm的石英比色皿在300～550 nm掃描其發(fā)射光譜。

同樣的方法掃描MAT-HSA在32 ℃和37 ℃時熒光光譜以及MAT-BSA的熒光光譜。

1.2.3 圓二色譜法 在室溫下，以pH 7.24的Tris-HCl緩沖溶液為參比，用2.00×10-3 mol/L的苦參堿溶液滴定10 mL濃度為3.00×10-6 mol/L的HSA溶液，在1 cm石英比色皿中掃描其190～250 nm內(nèi)的圓二色譜。用同樣的方法測定MAT-BSA的圓二色譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見光譜分析

紫外-可見吸收光譜法是研究藥物分子與蛋白質(zhì)之間相互作用的一種簡單可靠的方法。圖2為室溫27 ℃時不同濃度的苦參堿與HSA以及BSA相互作用的紫外-可見吸收光譜。從圖2中可看出，HSA和BSA的最大吸收波長均出現(xiàn)在280 nm處，這是主要由HSA和BSA中所含的色氨酸殘基引起的[6]，加入苦參堿后HSA和BSA的最大吸收峰的強度都明顯增強，而苦參堿在這一范圍內(nèi)沒有吸收峰，這就說明苦參堿與HSA或BSA相互作用形成一種新的復(fù)合物，并使得蛋白質(zhì)中的所有肽鏈伸展[7]。

2.2 熒光光譜

2.2.1 熒光猝滅 熒光猝滅指的是猝滅劑使熒光物質(zhì)的熒光強度不斷減小或熄滅的一種現(xiàn)象。HSA和BSA的內(nèi)源熒光主要是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基所引起的，其中在335 nm波長附近色氨酸殘基的熒光強度最強，304 nm附近的酪氨酸殘基居中，284 nm附近的苯丙氨酸殘基熒光強度最弱[7]。圖3是在室溫27 ℃時苦參堿與HSA和BSA相互作用的熒光光譜。從圖3中可以看出，HSA在338 nm處有一強的熒光發(fā)射峰，當(dāng)向HSA溶液中不斷加入藥物苦參堿時，隨著藥物濃度的不斷增大，HSA的熒光強度也隨之逐漸減弱，說明苦參堿與HSA相互作用形成了一種無熒光或是熒光較弱的新物種，從而使HSA的熒光不斷減弱。同樣的，苦參堿與BSA也可以相互作用形成新的復(fù)合物，并使得BSA的熒光猝滅。

2.2.2 熒光猝滅機理 引起熒光猝滅的原因一般有三種：動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和能量轉(zhuǎn)移[8]。為了進一步闡明苦參堿對HSA和BSA的熒光猝滅機理，分別在22、27和37 ℃時按式（1）[9-12]分別作出了苦參堿對HSA和BSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖。

式中，F(xiàn)0是未加入猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度，F(xiàn)是加入了猝滅劑后熒光物質(zhì)溶液的熒光強度，[Q]是猝滅劑的濃度，Ksv是Stern-Volmer猝滅常數(shù)，Kq是動態(tài)雙分子猝滅速率常數(shù)，？咨0是熒光物質(zhì)的熒光壽命，一般蛋白質(zhì)生物大分子的內(nèi)源熒光壽命為10-8 s[13]。所以根據(jù)方程式（1）以[Q]為橫坐標(biāo)，以F0/F為縱坐標(biāo)作出苦參堿對HSA和BSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖（圖4），并在表1中列出了Ksv和Kq的計算結(jié)果。從圖4中可以看出，隨著溫度的升高，Stern-Volmer曲線的斜率在不斷減小，從表1中可以看出苦參堿對HSA和BSA的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv也隨著溫度的升高而減小，雙分子猝滅速率常數(shù)Kq均遠(yuǎn)大于2.0×1010 L/（mol·s），說明苦參堿對HSA和BSA的熒光猝滅機理為靜態(tài)猝滅[14]。

2.2.3 結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點計算 在藥物小分子與生物大分子相互作用的過程中，其結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點數(shù)n以及熒光猝滅劑濃度[Q]符合Lineweaver-Burk方程[10，11]。

式中，F(xiàn)0是未加入猝滅劑苦參堿時熒光物質(zhì)血清白蛋白的熒光強度，F(xiàn)是加入了猝滅劑苦參堿后熒光物質(zhì)血清白蛋白溶液熒光強度，[Q]是猝滅劑苦參堿的濃度，lgKa為截距，n為斜率。因此在不同溫度下以lg～lg[Q]作圖（圖5），可以計算出不同溫度下的Ka和n值，計算結(jié)果見表2。通過表2中的數(shù)據(jù)可以得出，隨著溫度的升高，苦參堿與HSA和BSA的結(jié)合常數(shù)Ka增大，結(jié)合位點數(shù)n也有所增大，但變化較小，說明苦參堿與HSA和BSA的結(jié)合作用力隨著溫度的升高而增強，但結(jié)合位點數(shù)基本維持不變，證明苦參堿與HSA和BSA均可形成了1∶1的復(fù)合物，從而被血清白蛋白運輸并且儲存。

2.2.4 作用力類型 藥物小分子與生物大分子之間的相互作用力屬于分子間弱的相互作用，主要有疏水作用力（ΔH>0、ΔS>0）、范德華力或氫鍵（ΔS<0、ΔH<0）和靜電作用力（ΔH≈0、ΔS>0）[14]。通過公式（3）～（5）即可計算出藥物小分子與生物大分子相互作用時的焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能變ΔG，計算結(jié)果列于表3。

由表3可看出，苦參堿與HSA和BSA相互作用時均有ΔH>0、ΔS>0和ΔG<0，由此可知苦參堿與HSA和BSA之間的相互作用力類型均為疏水作用，且該反應(yīng)過程是一個吉布斯自由能降低的自發(fā)反應(yīng)，所以苦參堿與HSA和BSA之間的互相作用是通過熵增加來實現(xiàn)的。

2.3 圓二色譜

圓二色譜法（CD）是一種簡單、快速、且準(zhǔn)確度、靈敏較高的研究稀溶液中蛋白質(zhì)二級構(gòu)象的光譜技術(shù)。圖6給出了不同濃度的苦參堿對HSA和BSA影響的圓二色譜曲線。圖6中a曲線為HSA或BSA空白溶液，分別在208和222 nm處出現(xiàn)了兩個負(fù)峰，屬于α-螺旋的特征吸收峰，b、c和d分別是加入苦參堿后MAT-HSA體系和MAT-BSA體系的圓二色譜曲線。顯然，加入苦參堿后，隨著苦參堿濃度的增大，吸收峰的振幅相應(yīng)減弱，說明HSA和BSA分子內(nèi)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)部分?jǐn)嗔?，氫鍵作用力減弱，α-螺旋的含量相應(yīng)減少，疏水性減弱，證明HSA和BSA的二級結(jié)構(gòu)變的疏松[15]，而蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅的主要原因。

3 結(jié)論

利用苦參堿與HSA和BSA相互作用的熒光光譜和紫外可見光譜可發(fā)現(xiàn)，苦參堿與HSA和BSA均可形成基態(tài)復(fù)合物，苦參堿對HSA和BSA的內(nèi)源熒光均具有猝滅作用，其猝滅機理為靜態(tài)猝滅。通過圓二色譜分析可知，隨著苦參堿濃度的增加，HSA和BSA的振幅減小，說明蛋白質(zhì)中所含的α-螺旋量減少，輸水作用力減弱，證明了苦參堿可使HSA和BSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。熱力學(xué)參數(shù)的計算分析結(jié)果表明苦參堿與HSA和BSA之間的相互作用力類型均為輸水作用力，且其結(jié)合過程均為自發(fā)過程。

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