乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑對(duì)小鼠的急性毒性研究

張振東 楊亞軍 劉希望 孔曉軍 馬寧 申棟帥 李劍勇

摘要：為了對(duì)乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用簡(jiǎn)化寇氏法進(jìn)行了小鼠的急性毒性研究。首先通過(guò)預(yù)試驗(yàn)的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）確定給藥劑量及試驗(yàn)分組。皮下注射給藥，觀察7 d，記錄死亡數(shù)，計(jì)算LD50及95%的置信區(qū)間。結(jié)果表明，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑對(duì)小鼠的急性毒性LD50為5.903 g/kg，95%置信區(qū)間為5.105 3～6.415 0 g/kg。按照化學(xué)藥物劑量分級(jí)，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑可認(rèn)定為實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，說(shuō)明該藥臨床皮下注射使用安全。

關(guān)鍵詞：乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑；LD50；小鼠；急性毒性

中圖分類號(hào)：S859.83 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）11-0068-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.016

Abstract： An acute toxicity test of Eprinomectin in situ gel injection on mice was taken to evaluate its safety by simplified Karber's method. The dosage and grouping were determined based on the minimum lethal dose（LD100） and the maximum tolerated dose（LD0） in preliminary experiment. The mice were administered with Eprinomectin in situ gel injection and observed seven days. The number of deaths was recorded for calculating the LD50（lethal dose 50%） and the 95% confidence limit. The results showed that the acute toxicity LD50 of Eprinomectin in situ gel injection on mice was 5.903 g/kg，95% confidence limit ranges was from 5.105 3～6.415 0 g/kg. It indicated that the Eprinomectin in situ gel injection was non-toxic substances according to chemically drug classification.

Key words： Eprinomectin in situ gel injection；LD50；mice；acute toxicity

乙酰氨基阿維菌素（Eprinomectin，EPR）是由Merk公司1997年開(kāi)發(fā)出的大環(huán)內(nèi)酯類體內(nèi)外殺蟲(chóng)劑，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代抗寄生蟲(chóng)藥物[1]。EPR在防治畜類（特別是產(chǎn)乳期）的虱、螨、蠅等各種內(nèi)外寄生蟲(chóng)時(shí)效果很好并且休藥期很短，在治療奶牛寄生蟲(chóng)病時(shí)休藥期僅為1 d[2，3]。它也通過(guò)了美國(guó)FDA批準(zhǔn)可在動(dòng)物孕期和哺乳期安全使用，由于它在牛奶中的分布系數(shù)極低，目前在國(guó)外已被廣泛用于乳制品的生產(chǎn)行業(yè)。EPR是目前世界上使用較多的動(dòng)物抗寄生蟲(chóng)用藥物[4，5]。EPR殺滅寄生蟲(chóng)的作用機(jī)理與其他阿維菌素類藥物非常相似。EPR屬于γ-氨基丁酸（GABA）激動(dòng)劑，當(dāng)它達(dá)到一定濃度時(shí)可以和動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)傳導(dǎo)器等有效結(jié)合，這樣就會(huì)阻斷氯離子通道，進(jìn)而阻斷動(dòng)物的神經(jīng)末梢或者神經(jīng)肌細(xì)胞相互間的傳遞，從而使動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲(chóng)麻痹，繼而殺死寄生蟲(chóng)[6]。為此，以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的急性毒性試驗(yàn)，旨在為指導(dǎo)臨床科學(xué)、安全地使用該注射劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明系小鼠110只，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，體重18～22 g，雌雄各半，雌性未產(chǎn)未孕。雌雄分籠飼喂，自由采食飼料、飲水。試驗(yàn)前臨床健康觀察7 d，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。

供試藥品：乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)：171016。試驗(yàn)前，精密稱定處方中主藥及輔料，配制成0.05 g/mL的原位凝膠注射劑，待用。按照處方中各輔料的用料配比，配制輔料對(duì)照組（不含主藥乙酰氨基阿維菌素）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)試驗(yàn) 采用遞加法分別進(jìn)行乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑組預(yù)試驗(yàn)以及輔料對(duì)照組預(yù)試驗(yàn)。

乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑預(yù)試驗(yàn)：將20只昆明系小鼠平均分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給小鼠稱重，計(jì)算給藥劑量。最高劑量組為10.0 g/kg，最低劑量組為1.0 g/kg。皮下注射，觀察7 d，記錄小鼠的死亡數(shù)，得到最小致死劑量（LD100）（記為b）和最大耐受劑量（LD0）（記為a）。確定組數(shù)N以及各組間劑量比r。

N由預(yù)試驗(yàn)的最小致死劑量（LD100）b與最大耐受劑量（LD0）a的比值來(lái)確定。

r=lg-1[（lgb-lga）/（N-1）]

輔料對(duì)照組預(yù)試驗(yàn)方法同上。

1.2.2 正式試驗(yàn) 由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，輔料預(yù)試驗(yàn)的LD100大于5.0 g/kg，將小鼠樣本量增至10只，雌雄各半，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物毒性分級(jí)屬于實(shí)際無(wú)毒，因此得到結(jié)論，該注射劑輔料實(shí)際無(wú)毒。根據(jù)乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑預(yù)試驗(yàn)得到的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0），采用簡(jiǎn)化寇氏法[7]計(jì)算正式試驗(yàn)組數(shù)N以及各組間劑量比r。

根據(jù)乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將正式試驗(yàn)分為6組，其中包括空白對(duì)照組1組以及不同劑量給藥組5組。將60只昆明系小鼠隨機(jī)分為6組，每組雌雄各半。試驗(yàn)組的給藥劑量分別為10.000、6.750、4.500、3.000、2.000 g/kg，空白對(duì)照組給予等量的飲用水。皮下注射給藥，觀察7 d，自由飲水，采食，觀察小鼠的外觀體征、飲食欲、行為活動(dòng)、大小便等相關(guān)癥狀。給藥后4 h，持續(xù)觀察；4～8 h內(nèi)每30 min觀察一次；8～12 h，每1 h觀察一次；12～48 h，每3 h觀察一次；3 d后每天觀察3次，直至第7天結(jié)束。記錄每組小鼠死亡只數(shù)，對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢，與空白組對(duì)照，觀察各組織器官的病理變化。用簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算LD50及95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

輔料預(yù)試驗(yàn)組的LD100大于5.0 g/kg，增加試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量至10只，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物的毒性分級(jí)可以視為實(shí)際無(wú)毒。

乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑試驗(yàn)組預(yù)試驗(yàn)的LD100為10.0 g/kg，LD0為2.0 g/kg。從而確定正式試驗(yàn)的組數(shù)N為5。各組之間的劑量比值r=1.5。由此將正式試驗(yàn)分為6組，其中5組為不同劑量給藥組，1組為空白對(duì)照組。

2.2 正式試驗(yàn)結(jié)果

觀察給藥后動(dòng)物表現(xiàn)出的癥狀為：小鼠被毛逆亂、精神沉郁，全身顫栗，眼睛微閉，食欲不振，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，個(gè)別小鼠出現(xiàn)四肢無(wú)力等現(xiàn)象，死亡前出現(xiàn)全身震顫、側(cè)翻現(xiàn)象，持續(xù)10～30 min死亡。高劑量組的癥狀明顯，低劑量組癥狀較輕微。小鼠死亡時(shí)間集中在1～3 h，1 d后再無(wú)死亡現(xiàn)象，癥狀逐漸緩解。

對(duì)死亡動(dòng)物剖檢，與空白對(duì)照組相比，死亡動(dòng)物的口唇、四肢、尾巴青紫。高劑量組中，肝臟腫大，顏色為深褐色，有針尖狀散在出血點(diǎn)分布于肝臟邊緣，且高劑量組癥狀明顯。

正式試驗(yàn)小鼠死亡情況見(jiàn)表1。根據(jù)簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算LD50以及95%置信限，公式如下：

式中，Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)；i為組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差；p為各劑量組死亡率，q為各劑量組存活率；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動(dòng)物數(shù)；sx50為lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

計(jì)算得到LD50為5.903 g/kg，95%置信區(qū)間為5.105 3～6.415 0 g/kg。根據(jù)化學(xué)物急性毒性（LD50）劑量分級(jí)可知，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑為實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。

3 小結(jié)

試驗(yàn)嚴(yán)格遵守《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》[8]中對(duì)藥物急性毒性試驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)選用SPF級(jí)昆明系小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，保證試驗(yàn)動(dòng)物本身清潔無(wú)污染，有效消除試驗(yàn)誤差。在給藥過(guò)程中，嚴(yán)格按照皮下注射給藥[9]中的操作，以防由于操作方法不當(dāng)而導(dǎo)致小鼠死亡，影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由試驗(yàn)結(jié)果可知，小鼠給予乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑后，出現(xiàn)精神倦怠、食欲減退、生長(zhǎng)遲緩等現(xiàn)象，根據(jù)小鼠的死亡數(shù)計(jì)算乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的半數(shù)致死劑量（LD50）為5.903 g/kg，95%置信區(qū)間為5.105 3～6.415 0 g/kg。由化學(xué)物毒性分級(jí)可知，乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑為實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。乙酰氨基阿維菌素作為一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代抗寄生蟲(chóng)藥物[10]，本研究對(duì)其新制劑乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為該制劑的后續(xù)研究及臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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