采收期對費約果活性氧代謝及AsA—GSH循環(huán)的影響

陸云梅 黃仁華

摘要：為了闡明采收期對費約果貯藏期間活性氧代謝的影響，確定果實最佳采收時期，以品種Coolidge果實為材料，分析了始熟期（花后130 d）、盛熟期（花后150 d）和過熟期（花后170 d）采收果實在貯藏期間果肉線粒體細胞活性氧代謝及抗壞血酸—谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)的差異。結果顯示，盛熟期采收的果實在貯藏后期H2O2含量和O2-·產生速率顯著高于始熟期和過熟期采收的果實，而貯藏前6 d無顯著差異；同時，果實在貯藏前期，抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）等酶活性以及抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量變化較小，但9 d后呈迅速增加的變化趨勢，其中DHAR、GR活性以及AsA和GSH含量增加速率以過熟期采收的果實最大，其次為始熟期和盛熟期。因此，針對果實貯藏期活性氧代謝及AsA-GSH循環(huán)而言，采收時間對費約果短期貯藏無顯著影響，而中長期貯藏以盛熟期（花后150 d）采收為最佳時期。

關鍵詞：采收期；費約果；線粒體；活性氧代謝；AsA-GSH循環(huán)

中圖分類號：S667.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0050-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.012

Abstract： In order to elucidate the effects of harvest time on active oxygen metabolism of Feijoa sellowiana fruit during storage and determine the best harvest time，the active oxygen metabolism and AsA-GSH cycle in mitochondria of Feijoa sellowiana pulp harvested at initial ripe stage （IRS，130 d after flowering），full ripe stage （FRS，150 d after flowering） and excess ripe stage（ERS，170 d after flowering） were studied during the storage. The results showed that the H2O2 content and O2-· production rate in FRS fruits was significantly higher than those in IRS and ERS fruits during the late storage stage，but there were no significant difference before 6 d storage. At the same time，there were no significant changes in APX，DHAR，GR activities and AsA and GSH contents during the early stage of postharvest storage. After storage 9 d，the rapidly increasing trend in these indexes were showed and the biggest increasing rate was found in ERS fruits，followed by ERS fruits and FRS frruits. Therefore，in the case of active oxygen metabolism and AsA-GSH cycle during the fruit storage period，harvesting time had no significant difference on the F. sellowiana fruits in short-term storage，but for long-term storage，the full ripe stage（150 d after anthesis） was optimal harvesting time.

Key words： harvesting time； Feijoa sellowiana； mitochondria； active oxygen metabolism； AsA-GSH cycle

費約果（Feijoa sellowiana Berg.）又名肥吉果、菲油果、南美稔、鳳榴，系桃金娘科，屬常綠灌木或小喬木[1]，起源于巴西最南端、阿根廷北部、巴拉圭和烏拉圭西部的山區(qū)。目前，新西蘭、法國、西班牙、葡萄牙、意大利、日本等國均有專門果園種植，其中新西蘭是種植發(fā)展最好的國家，在中國，西南科技大學生命科學與工程學院于2004年從新西蘭將其引入四川綿陽地區(qū)，經過近十年的馴化引種，已逐步進入推廣種植階段[2]。費約果果實芳香，具有人體需要的多種營養(yǎng)成分，如礦質元素、脂肪酸、維生素、多酚、類胡蘿卜素等[3-5]，是目前國際市場熱銷的新型水果之一。

經過近十幾年的引種栽培發(fā)現，費約果存在果實成熟期不一致的問題，同一品種從始熟期到過熟期可達40 d左右。在新西蘭對費約果的采收大多采用自然掉落的方式，很大程度上影響了果實的上市時間和貨架期[1]。適宜的采收期對保持果實良好的風味品質以及延長貯藏時間具有重要的意義，采收過早，尚未形成品種固有的品質和風味，且耐藏性和抗病性差；采收過遲，果肉風味變淡，采后果實易衰老、不耐貯運[6]。目前關于果實在貯藏期間衰老的機理研究主要集中于乙烯對果實成熟衰老的調控[7]，細胞壁多糖的降解[8，9]、呼吸速率的變化[10，11]等方面，而對果實貯藏期衰老過程中線粒體細胞活性氧代謝機制的研究較少。為此，試驗針對不同采收期對費約果貨架期的影響，研究了不同采收期對費約果貯藏過程中果肉線粒體細胞活性氧代謝及AsA-GSH循環(huán)的差異，以期為費約果的合理采收以及衰老機理提供新的認識，進而為完善果實采后貯藏技術體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

費約果果實采自西南科技大學西山校區(qū)費約果栽培園Coolidge品種，該品種于2004年從新西蘭引進，栽培表現良好。2016年于果實始熟期（花后130 d）、盛熟期（150 d）和過熟期（花170 d）分別進行采摘，采摘時選擇樹體東、南、西、北4個方向高度基本一致，果形端正、無病蟲害、大小均勻的果實，每次采摘60個果實運回實驗室并用2%的次氯酸鈉消毒處理，2 min后用去離子水洗凈，風干，用黑色聚乙烯塑料袋包裝進行貯藏，分別在果實貯藏0、3、6、9、12和15 d取樣測定。

1.2 線粒體的制備

隨機取10枚果實取果肉50 g，用100 mL提取液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，內含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA、0.5% PVP、0.1% 半胱氨酸）在4 ℃研磨，用4層紗布過濾，濾液在4 ℃下 6 137 r/min離心10 min， 以后的離心和洗滌步驟參照Van Emmerik等[12]的方法，取上清液在4 ℃下11 481 r/min離心分離20 min；將沉淀用20 mL洗滌液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，內含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L 甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1%BSA）洗滌，4 ℃下11 481 r/min離心分離20 min，再取上清液離心分離，得到的沉淀即為線粒體，用1.5 mL懸浮液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，內含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA）懸浮，線粒體內蛋白質含量用牛血清蛋白標定法測定。

1.3 測定方法

采用林植芳等[13]的方法測定過氧化氫（H2O2）含量，并依據王愛國等[14]的方法測定超氧陰離子自由基（O2-·）產生速率?？箟难幔ˋsA）和脫氫抗壞血酸（DHAsA）含量測定參考Arakawa等[15]和Nakagawara等[16]的方法；還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量測定參考Castillo等[17]的方法；單脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定參考Shigeoka等[18]的方法，以1 min內OD340 nm變化0.01個單位定義為1個酶活性單位；谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定參考Smith等[19]的方法，以1 min內每克鮮樣OD340 nm變化0.01個單位定義為1個酶活性單位。以上測定均重復3次。

1.4 數據分析

試驗數據采用SAS 8.1 ANOVA過程作差異顯著性檢驗，并用LSD法作多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 采收期對費約果貯藏期間線粒體細胞H2O2含量和O2-·產生速率的影響

從圖1可以看出，3種不同采收期費約果果肉線粒體細胞H2O2含量的變化在貯藏前6 d差異不明顯，均表現為緩慢增加，說明費約果離開樹體短期內H2O2代謝相對穩(wěn)定；貯藏9 d后，3種采收期果肉線粒體細胞H2O2含量均出現迅速上升的變化趨勢，且過熟期和始熟期采收果實H2O2含量增加的速率顯著高于盛熟期，說明過早和過晚采收費約果均會引起果實貯藏后期H2O2含量的紊亂。

與果肉線粒體細胞H2O2含量的變化相似，O2-·產生速率在果實貯藏前6 d也呈緩慢增加的過程，且3種不同采收期果實在貯藏0、3和6 d時O2-·產生速率均無顯著差異（圖2）。貯藏第9天，盛熟期采收的果實O2-·產生速率為0.20 μmol/（min·mg protein），并顯著高于始熟期和過熟期采收的果實；而貯藏最后6 d，過熟期采收的果實O2-·產生速率顯著高于始熟期和盛熟期采收的果實，說明過熟期采收的果實經過長期貯藏可能會引起O2-·代謝紊亂，導致費約果腐爛，失去商品價值。

2.2 采收期對費約果貯藏期間線粒體細胞AsA-GSH循環(huán)酶活性的影響

圖3反映了不同采收期對費約果貯藏期間果肉線粒體細胞APX活性的影響。果實采收時，3種采收期采收的果實APX活性差異不顯著。在整個貯藏過程中，過熟期采收的果實APX活性變化比較平緩，至貯藏結束時APX較采收時僅僅增加了0.76 U/mg protein，而盛熟期和始熟期采收的果實APX活性在貯藏前9 d變化相對緩慢，9 d后呈迅速增加的變化趨勢，至貯藏結束時APX活性較采收時分別增加了3.49和1.46 U/mg protein。

從圖4可以看出，不同采收期采收的費約果果肉線粒體細胞GR活性在整個貯藏過程中均呈上升的變化趨勢。過熟期采收的果實GR活性隨著貯藏時間的延長增加速率明顯高于始熟期和盛熟期采收的果實，至貯藏結束時其活性達到了5.39 U/mg protein，相當于采收時的8.90倍；始熟期采收的果實在前9 d變化較小，之后3 d活性變化最大，至貯藏結束時活性較采收時增加了2.84 U/mg protein；盛熟期采收的果實GR活性在整個貯藏期間變化比較平緩，未出現急劇變化過程。

由圖5可見，不同采收期采收的費約果果肉線粒體細胞DHAR活性在貯藏前6 d基本沒有變化，6～12 d不斷增加，之后迅速下降。始熟期和過熟期采收的果實DHAR活性變化趨勢一致，在貯藏12 d時出現最大值，活性分別為3.02和2.77 U/mg protein，顯著高于其他貯藏期；除貯藏第9天外，盛熟期采收的果實DHAR活性在整個貯藏過程中均顯著低于始熟期和過熟期采收的果實。

2.3 采收期對費約果貯藏期間線粒體細胞抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響

不同采收期費約果在貯藏過程中果肉線粒體AsA和DHAsA含量及比值的變化見表1。從表1可以看出，始熟期采收的果實果肉線粒體AsA含量在果實采收時（貯藏0 d）極顯著高于盛熟期和過熟期采收的果實。在貯藏前6 d，始熟期和過熟期采收的果實果肉線粒體AsA和DHAsA含量均呈上升趨勢，而在貯藏第9 d，AsA含量出現了下降，之后又持續(xù)上升直至貯藏15 d出現最大值，其最大含量分別為1.49和1.93 μmol/mg protein；除貯藏9 d外，盛熟期采收的果實AsA和DHAsA含量在整個貯藏過程中均低于始熟期和過熟期采收的果實，最大值也出現在貯藏末期（15 d），其含量為1.05 μmol/mg protein。隨著貯藏時間的延長，3種不同時期采收的果實AsA與DHAsA的比值均逐漸下降，至貯藏結束時，盛熟期采收的果實果肉線粒體AsA/DHAsA值明顯高于始熟期和過熟期采收的果實，說明盛熟期采收的果實在貯藏期間能更好地維持AsA和DHAsA的平衡。

從表2可以看出，不同采收期果實在采收時果肉線粒體GSH含量差異較大，其中盛熟期果實采收時GSH含量最低，相當于始熟期和過熟期采收果實的64.87%和74.48%，而在整個貯藏過程中，除貯藏9 d外，盛熟期采收果實的GSH含量也均極顯著低于另兩個時期采收的果實；從表2還可以看出，3種時期采收的果實GSH和GSSG含量總體均呈上升趨勢，其中貯藏前6 d，GSH含量變化平緩，而貯藏6 d后果實GSH和GSSG含量變化比較迅速，尤其是始熟期和過熟期采收的果實，至貯藏末期GSH含量分別是采收時的2.90和4.54倍；另外，隨著貯藏時間的延長，GSH/GSSG值也呈不斷下降的趨勢，至貯藏末期3種采收期下的果實果肉線粒體GSH/GSSG值分別為采收時的46.62%、72.18%和42.25%。

3 小結與討論

果實在貯藏過程中，細胞內活性氧自由基的積累會不斷增加而使膜脂質過氧化作用加強，破壞機體組織結構，導致果實腐爛[20]。適宜的采收期對維持果實商品性和貨架期至關重要，果實貯藏期間，胞內產生過量的H2O2，在正常情況下可通過Halliwell-Asada途徑清除，果實采收過早或過晚均會影響 Halliwell-Asada途徑中關鍵酶（APX、GR以及DHAR等）和底物（AsA和GSH）的運轉，從而破壞活性氧代謝平衡[21]。試驗中對費約果分3個成熟期進行采收，結果顯示，不同采收期果肉線粒體細胞H2O2含量和O2-·產生速率在貯藏前6 d變化不顯著，說明采收期在費約果短期貯藏期間對活性氧代謝影響不大；但是果實貯藏9 d后，果肉線粒體細胞H2O2含量和O2-·產生速率均出現迅速上升的變化趨勢，且過熟期和始熟期采收果實上升的速率極顯著高于盛熟期，說明過早和過晚采收費約果均可能會引起果實貯藏后期活性氧代謝的紊亂，不利于長期貯藏。

在AsA-GSH循環(huán)中，DHAR、APX以及GR在AsA和GSH參與的信號轉導途徑中起關鍵作用，其中DHAR可以催化AsA的再生，試驗中DHAR活性在果實貯藏前12 d不斷增加，這可能是為適應體內活性氧積累的一種適應性調節(jié)，有利于AsA的再生。過熟期和始熟期采收果實在貯藏期間DHAR活性均極顯著高于盛熟期采收的果實，一方面可能與過熟期和始熟期果實采收時DHAR活性較高有關，另一方面可能是由于這兩個時期采收的果實貯藏期間活性氧產生速率過高，刺激了DHAR活性；大量研究表明，APX活性直接影響到AsA的含量，在AsA-GSH 循環(huán)代謝中，APX被認為是植物細胞中有效分解H2O2的重要酶之一，APX 活性的增加有助于果實耐貯性的提高[22]，試驗結果顯示，盛熟期采收的果實果肉線粒體細胞APX活性在貯藏后期迅速增加，其活性增加速率極顯著高于始熟期和過熟期，由此可推測盛果期采收的費約果果實較始熟期和過熟期更耐貯藏。

GR是普遍存在于動植物細胞中的抗氧化誘導酶，對清除活性氧起積極作用，當活性氧的含量危及到GR的活性時，植物就會受到傷害。試驗結果表明，果實在貯藏前期GR的活性比較穩(wěn)定，而貯藏后期迅速增加，筆者認為貯藏后期酶活性的增加可能是受到了活性氧的誘導，AsA-GSH循環(huán)做出了適應性反應以提高活性氧清除效率；同時試驗結果還顯示，過熟期采收的果實GR活性在貯藏后期增長速率顯著高于始熟期和盛熟期采收的果實，說明過熟期采收的果實在貯藏后期受活性氧破壞的程度更嚴重，不利于中長期貯藏；另一方面，果實在貯藏過程中，GR可以誘發(fā)增加抗氧化劑的合成，如AsA、GSH等，從而限制脂類過氧化，因此通過提高GR的活性可能會增加GSH的積累，試驗中GSH的含量變化與GR活性的變化達到極顯著正相關（r=0.944 1，P=0.01），也證實了以上觀點。

植物AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的AsA/DHAsA、GSH/GSSG比率反映了細胞內的氧化還原勢，而細胞內的氧化還原勢決定體內電子流，電子流又在體內的信號轉導方面占重要地位，調控ASA、GSH參與信號轉導途徑，Ziegler[23]認為較高的AsA/DHAsA和GSH/GSSG比率對維持氧化-還原反應順利進行和AsA在氧化脅迫下再生很有必要。試驗結果表明，費約果貯藏過程中果肉線粒體細胞AsA/DHAsA和GSH/GSSG的比率均處于下降的趨勢，至貯藏結束時，盛熟期采收的果實果肉線粒體AsA/DHAsA以及GSH/GSSG值顯著高于始熟期和過熟期采收的果實，說明費約果果實在盛熟期采收有助于維持AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的平衡，促進AsA再生，但本試驗中始熟期和過熟期采收的果實AsA含量在貯藏期間反而高于盛熟期采收的果實，可能是由于始熟期和過熟期采收的果實在貯藏期間活性氧的大量積累刺激了AsA合成，使機體組織中AsA和DHAsA總量得到了增加，其合成機理有待進一步研究。

從費約果果實貯藏期間果肉線粒體細胞活性氧代謝來看，盛果期（花后150 d左右）采收有利于維持果實貯藏期間活性氧代謝平衡，而采收過早或過晚活性氧產生速率均明顯提高，不利于果實中長期貯藏；同時，盛熟期采收的果實果肉線粒體細胞中在維持AsA-GHS循環(huán)平衡方面也顯著高于始熟期和過熟期采收的果實，保證了Halliwell-Asada途徑在清除活性氧方面底物和關鍵酶高效運轉，有利于果實中長期貯藏。

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