L-鼠李糖異構(gòu)酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景

陳佳俊，陳自衛(wèi)，張文立，江波，張濤，沐萬孟

(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

L-鼠李糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.14,L-rhamnose isomerase,L-RI)具有廣泛的底物譜，能夠可逆催化包括L-鼠李糖與L-鼠李酮糖以及D-阿洛糖與D-阿洛酮糖在內(nèi)的多對五元、六元酮醛糖之間的異構(gòu)化反應(yīng)[1]，在生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)稀有糖中具有重要作用。稀有糖(rare sugar)是一類重要的碳水化合物，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域中具有非常重要的作用。國際糖協(xié)會(ISRS)對稀有糖的定義為“在自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物”[2]。D-阿洛糖是一種很有應(yīng)用前景的稀有糖，其在結(jié)構(gòu)上和D-葡萄糖在C-3互為差向異構(gòu)體，同時和D-阿洛酮糖互為醛酮糖異構(gòu)體(見圖1)，具有清除活性氧自由基、抑制高鹽誘導(dǎo)類高血壓、冷凍防護、免疫抑制、抑制腫瘤、抗炎癥等生理功能[3]。

圖1 D-葡萄糖、D-阿洛糖和D-阿洛酮糖的Fisher投影式Fig.1 Fisher projection formulas of D-glucose, D-allose and D-psicose

研究表明，L-RI在生物法工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛糖中具有巨大的潛力，文中綜述了近年來國內(nèi)外關(guān)于L-RI的結(jié)構(gòu)功能、催化機理、酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用于生物法生產(chǎn)D-阿洛糖方面的研究進(jìn)展。

1 L-RI的結(jié)構(gòu)

KORNDORFER等人在2000年首次通過多重同晶置換法成功解析了來自大腸桿菌(E.coli)的L-RI晶體結(jié)構(gòu)(PDB登錄號：1D8W)[4]。來自E.coli的L-RI在晶體中以緊密的四聚體形式存在(見圖2-a)，表觀相對分子質(zhì)量在188 kDa左右，E.coliL-RI的單亞基結(jié)構(gòu)由420個氨基酸組成，亞基結(jié)構(gòu)大體包括3個功能域：N-端結(jié)構(gòu)域、中心結(jié)構(gòu)域和C-端結(jié)構(gòu)域。中心結(jié)構(gòu)域是由8個α-螺旋(見圖2-b，α1-α8)和8個β-折疊(見圖2-b，β1-β8)共同組成的(β/α)8桶狀核心區(qū)域。N-端和C-端的殘基通過幾段α-螺旋無規(guī)卷曲成一個小結(jié)構(gòu)域(見圖2-b，藍(lán)色為N-端殘基，紅色為C-端殘基)，參與單體間的相互作用及活性部位的構(gòu)成。E.coliL-RI結(jié)構(gòu)中還存在兩個可能用于金屬離子結(jié)合的位點，一個稱作“Zn2+”點，被認(rèn)為是酶的底物結(jié)合位點，用于幫助穩(wěn)定底物的構(gòu)象，參與協(xié)調(diào)的關(guān)鍵氨基酸殘基為Glu234、Asp267、His294和Asp334；另一個“Mn2+”點則被認(rèn)為是酶的催化位點，用于幫助質(zhì)子轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)底物的催化過程，參與協(xié)調(diào)的關(guān)鍵氨基酸殘基為His262和Asp296。這些組成L-RI活性中心的關(guān)鍵氨基酸殘基在已報道的L-RI中均高度保守。

圖2 E. coli L-RI的四聚體結(jié)構(gòu)(a)與亞基結(jié)構(gòu)(b)[4]Fig.2 Tetrameric structure (a) and subunit structure (b) of L-RI from E. coli[4]

同時，海藻糖異構(gòu)酶(fucose isomerase, PDB登錄號：1FUI)[5]，磷酸甘油醛異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase, PDB登錄號：1TIM)[6]，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(glucose 6-phosphate isomerase, PDB登錄號：1PGI)[7]，磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase, PDB登錄號：1PMI)[8]和木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase, PDB登錄號：3XIM)[9]等醛酮糖異構(gòu)酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被陸續(xù)報道。通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，E.coliL-RI的晶體結(jié)構(gòu)與木糖異構(gòu)酶(D-xylose isomerase,D-XI)最為接近，序列相似度達(dá)到13%，推測二者來源于同一前體基因。二者的(β/α)8桶狀核心區(qū)域十分相似，但與D-XI不同的是，E.coliL-RI在活性中心區(qū)域周圍存在一些強疏水性的氨基酸殘基(Val53、Ile105、Tyr106、Phe336)，這一特殊的疏水環(huán)境對應(yīng)在底物的C-6附近，推測是用于底物識別，從而解釋了E.coliL-RI對L-鼠李糖的底物親和力高于L-甘露糖。

2 L-RI的催化機理

KORNDORFER等人通過對E.coliL-RI晶體結(jié)構(gòu)的分析，推測金屬離子介導(dǎo)的負(fù)氫離子轉(zhuǎn)移機制可能是L-RI催化L-鼠李糖異構(gòu)化生成L-鼠李酮糖的主要反應(yīng)機制[4]。YOSHIDA等人又對P.stutzeri來源的L-RI晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，并研究了該酶與反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)-鼠李糖和D-阿洛糖在結(jié)晶狀態(tài)下的結(jié)合情況來推測其催化機理[10]。3年后該團隊又通過X射線結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步對P.stutzeriL-RI的催化過程進(jìn)行了研究，得到如圖3所示的催化預(yù)測過程[11]。

他們認(rèn)為,L-RI活性中心的催化位點(見圖3 Mn2)存在兩種形式，即AD型和BC型(見圖3-A和圖3-D)，并通過金屬離子位移的方式實現(xiàn)兩種形式之間的互換。其中AD型用于識別五元環(huán)的酮糖底物(見圖3-B)，底物的O-1、O-2和O-3與金屬離子Mn1和Mn2形成配位鍵，Asp327參與呋喃糖的開環(huán)，并協(xié)助質(zhì)子從O-2轉(zhuǎn)移至O-5。開環(huán)后，具有催化活性的水分子(W4)介入?yún)f(xié)助從O-1到O-2的質(zhì)子轉(zhuǎn)移，再通過Trp179保護的負(fù)氫離子(H-)進(jìn)攻C-2，實現(xiàn)酮糖到醛糖的異構(gòu)化反應(yīng)。而BC型則用于識別六元環(huán)的醛糖底物(見圖3-E)，底物的O-2, O-3與金屬離子Mn1形成配位鍵。與AD型不同，參與吡喃糖開環(huán)的是具有催化活性的水分子。開環(huán)后，通過Mn2的位移使催化位點由BC型變?yōu)锳D型，激活W4介入?yún)f(xié)助從O-2到O-1的質(zhì)子轉(zhuǎn)移，再由H-進(jìn)攻C-1，完成醛糖到酮糖的異構(gòu)化反應(yīng)。

3 L-RI的微生物來源及其酶學(xué)性質(zhì)

3.1 L-RI的微生物來源

研究發(fā)現(xiàn)，L-RI廣泛存在于各種微生物中，包括E.coli[12]、Lactobacillusplantarum[13]、Pseudomonassp. strain LL172[14]、Pseudomonasstutzeri[15]、BacilluspallidusY25[16]、ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumNTOU1[17]、ThermotogamaritimaATCC 43589[18]、MesorhizobiumlotiTono[19]、BacillushaloduransATCC BAA125[20]、CaldicellulosiruptorsaccharolyticusATCC 43494[21]、DictyoglomusturgidumDSMZ6724[22]、BacillussubtilisATCC 23857[23]、B.subtilisstr.168[24]、ThermobacilluscompostiKWC4[25]、CaldicellulosiruptorobsidiansisOB47[26]和Clostridiumstercorarium[27]，表1給出了已經(jīng)被報道的L-RI的十多種微生物來源，并概括了這些不同微生物來源的L-RI的酶學(xué)性質(zhì)。

表1 不同微生物來源的L-RI酶學(xué)性質(zhì)比較Table 1 Comparison of biochemical properties of L-RIs from various microbial sources

注：NR: 未見報道。

3.2 L-RI的酶學(xué)性質(zhì)

3.2.1L-RI反應(yīng)最適溫度

反應(yīng)溫度是生物催化醛酮糖異構(gòu)反應(yīng)中一個非常重要的參數(shù)，D-阿洛糖與D-阿洛酮糖之間的異構(gòu)化反應(yīng)發(fā)生在較高的溫度可以適當(dāng)提高反應(yīng)速率，使反應(yīng)平衡向生成D-阿洛糖的方向移動，提高產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以降低D-阿洛酮糖的黏度，提高D-阿洛酮糖的溶解度。但是過高的溫度容易增加非酶褐變，生成副產(chǎn)物，導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅提高，無法滿足實際工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

來源于不同微生物的L-RI的最適溫度均保持在較高的溫度(≥60 ℃)，例如來自B.subtilisATCC 23857[23]、T.maritimaATCC 43589[18]和C.saccharolyticusATCC 43494[21]的L-RI，最適溫度分別為60、85和90 ℃。C.saccharolyticusATCC 43494[21]是迄今為止報道的最為耐熱的L-RI。但不同微生物來源的L-RI，其高溫耐熱性存在明顯差異，通過比較發(fā)現(xiàn)嗜熱微生物來源的D.turgidumDSMZ6724[22]、T.maritimaATCC 43589[18]和C.saccharolyticusATCC 43494[21]，其L-RI的最適溫度和高溫耐熱性相當(dāng)高，具備工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛糖的潛力。

3.2.2L-RI反應(yīng)最適pH值

目前已經(jīng)被鑒定報道的十多種不同微生物來源的L-RI的最適pH均在中性及堿性范圍內(nèi)。B.haloduransATCC BAA-125[20]、C.saccharolyticusATCC 43494[21]和T.saccharolyticumNTOU1[17]，這三者來源的L-RI最適pH值均為7.0；來自M.lotiTono[19]和P.stutzeri[15]的L-RI，其最適pH達(dá)到9.0。而C.saccharolyticusATCC 43494[21]的L-RI在pH 6.0時僅能殘留20%左右的相對酶活?？傮w來說，目前鑒定報道的L-RI大多能在中性及堿性范圍內(nèi)進(jìn)行催化作用，在酸性范圍內(nèi)催化活力相對較低。

目前工業(yè)上生物法合成D-阿洛糖主要是利用兩步酶反應(yīng)來實現(xiàn)，先利用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase, DPE)將D-果糖差向異構(gòu)化為D-阿洛酮糖，再利用L-RI將D-阿洛酮糖酮醛異構(gòu)化為D-阿洛糖[3]。因為DPE的最適pH值為7.5～9.0[28]，L-RI最適pH值大多為7.0～8.5。所以D-阿洛糖的工業(yè)生產(chǎn)反應(yīng)pH值最好為7.5～8.5之間催化環(huán)境不宜過堿，否則會大大增加底物的非特異性褐變，同時催化環(huán)境也不能過酸，過酸的情況下會對L-RI催化過程的質(zhì)子解離產(chǎn)生不利影響。

3.2.3 金屬離子與L-RI

金屬離子是醛酮糖異構(gòu)酶重要的輔因子，通常結(jié)合在酶的活性中心，對于醛酮糖異構(gòu)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用。L-RI與其他醛酮糖異構(gòu)酶一樣，通常需要金屬離子的參與來發(fā)揮酶活。研究表明不同微生物來源的L-RI大多數(shù)都呈現(xiàn)出嚴(yán)格的金屬離子依賴性，Mn2+和Co2+是常見的兩種依賴離子。如來自C.saccharolyticusATCC 43494和T.saccharolyticumNTOU1的L-RI，這兩種L-RI在當(dāng)金屬離子濃度很低(0.1 mmol/L)或不添加金屬離子時，不具備催化活力，而適當(dāng)添加Co2+則會明顯提高酶活力[17, 21]。

YOSHIDA[10]等人通過對P.stutzeriL-RI晶體結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)在L-RI的活性區(qū)域內(nèi)，存在2個供金屬離子結(jié)合的位點(見圖4, M-1、M-2)，金屬離子與配體結(jié)合形成六配位的畸變八面體構(gòu)型，與M-1結(jié)合的配體包括Glu219、Asp254、His281、Asp327和2個水分子(W-1、W-2)，與M-2結(jié)合的配體包括His257、Asp289和4個水分子(W-2、W-3、W-4、W-5)。結(jié)合位點M-1用于穩(wěn)定底物的構(gòu)象，促進(jìn)酶與底物的結(jié)合；催化位點M-2用于幫助質(zhì)子轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)底物的催化。

圖4 P. stutzeri L-RI的金屬離子結(jié)合位點[10]Fig.4 Metal-binding site of the P. stutzeri L-RI[10]

3.2.4L-RI的酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

L-RI具有廣泛的底物譜，能夠催化包括多對五元、六元酮醛糖之間的異構(gòu)化反應(yīng)，表2中比較了不同來源的L-RI對3種底物的動力學(xué)參數(shù)。

表2 不同微生物來源的L-RI動力學(xué)參數(shù)比較Table 2 Comparison of kinetic parameters of L-RI from various microbial sources

注：NR:未見報道。

所有報道的微生物來源的L-RI具備一個共同點，即對L-鼠李糖都有更高的親和力，更易催化L-鼠李糖到L-鼠李酮糖的異構(gòu)化反應(yīng)。同時，不同微生物來源的L-RI對各種底物的特異性存在一定的差異，例如來源于E.coli的L-RI能催化L-鼠李糖、L-來蘇糖和L-甘露糖的異構(gòu)化反應(yīng)，但D-阿洛糖和D-核糖都無法作為底物，而來源于P.stutzeri的L-RI則有著更廣泛的底物譜[4,10]。KORNDORFER和YOSHIDA等人通過對L-RI晶體結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)，E.coliL-RI中存在1個由Val53、Ile105、Tyr106和Phe336形成的特殊疏水腔來識別底物，導(dǎo)致其具有嚴(yán)格的底物特異性[4]。而P.stutzeriL-RI的底物結(jié)合位點與底物1、2和3位置的結(jié)合形式與E.coliL-RI一致，而與底物4、5和6位置的結(jié)合形式更接近于D-木糖異構(gòu)酶(D-XI)，不存在疏水腔，底物僅僅與鄰近的Phe66形成疏水相互作用，因而具有更廣泛的底物特異性[10]。

YOSHIDA等人還發(fā)現(xiàn)329位的絲氨酸(Ser)對于P.stutzeriL-RI催化過程的底物特異性影響較大。研究中，引入突變體S329F(突變?yōu)楸奖彼幔刃?yīng)于E.coliL-RI)、S329K(突變?yōu)橘嚢彼幔刃?yīng)于D-XI)、S329L(突變?yōu)榱涟彼?和S329A(突變?yōu)楸彼幔O(shè)計為空白對照)[29]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體L-RI的米氏常數(shù)Km均有不同程度的增加，同時催化效率kcat/Km均有不同程度的降低，表明該位置影響著酶與底物的結(jié)合和催化。同時，還發(fā)現(xiàn)將P.stutzeriL-RI的C端截去2個殘基(I429、I430)后的突變體，其催化效率有了一定的提高，可能是由于疏水的C端正處于P.stutzeriL-RI亞基與亞基分子的表面，部分覆蓋了活性部位，阻礙了底物的結(jié)合以及產(chǎn)物的釋放。

4 L-RI與D-阿洛糖的生產(chǎn)

目前為止，利用不同微生物來源的酶進(jìn)行D-阿洛糖合成的情況如表3所示。由表3可以發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)報道的能以D-阿洛酮糖為底物合成D-阿洛糖的微生物來源的酶主要包括半乳糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Galactose-6-phosphate isomerase, GPI)，核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(ribose-5-phosphate isomerase, RPI)和L-鼠李糖異構(gòu)酶(L-RI)。來自C.thermocellum和來自T.lettingae的RPI分別能夠在pH 7.5，50 ℃和pH 8.0，70 ℃下獲得33%和32%的平衡轉(zhuǎn)化率[32-34]。來自L.lactis的GPI能夠在pH 7.0，30 ℃下以100 g/LD-阿洛酮糖生成25 g/LD-阿洛糖，但其最適反應(yīng)溫度較低，僅僅為30 ℃，且會伴隨副產(chǎn)物D-阿卓糖的生成[35]。P.stutzeriL-RI是最早報道的用以生產(chǎn)D-阿洛糖的L-RI。為了提高D-阿洛糖的生產(chǎn)效率，MENAVUVU和MORIMOTO等人利用戊二醛交聯(lián)法，對P.stutzeriL-RI進(jìn)行了固定化，采用固定化酶連續(xù)反應(yīng)器的方式后，P.stutzeriL-RI平衡轉(zhuǎn)化率由游離態(tài)下的25%，提高到了30%，但無論是游離態(tài)，還是固定化態(tài)，P.stutzeriL-RI在催化D-阿洛酮糖生產(chǎn)D-阿洛糖過程中始終伴隨著副產(chǎn)物D-阿卓糖的產(chǎn)生[30-31]。

表3 利用不同微生物來源的酶以D-阿洛酮糖為底物生產(chǎn)D-阿洛糖Table 3 D-allose production from D-psicose by enzymes from various microbial sources

繼P.stutzeriL-RI的研究后，對微生物來源的生產(chǎn)D-阿洛糖的L-RI的研究工作不斷開展。來自T.saccharolyticumNTOU1的L-RI，在pH 7.0，75 ℃時有最大酶活，轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖為D-阿洛糖時，平衡比例為66∶34，75 ℃時半衰期為2 h，無副產(chǎn)物產(chǎn)生[17]。重組T.compostiKWC4 L-RI最適pH為7.5，最適溫度為65 ℃，65 ℃半衰期為3.65 h，沒有副產(chǎn)物生成，平衡轉(zhuǎn)化率為23.34 %[25]。在目前報道的能以D-阿洛酮糖為底物生產(chǎn)D-阿洛糖的微生物來源的L-RI中，重組C.stercorariumL-RI具有最高的比活力和催化效率(kcat/Km)，在pH 7.0，75 ℃時有最大酶活，轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖為D-阿洛糖時平衡轉(zhuǎn)化率為33%，時空產(chǎn)率高達(dá)79.6 g/(L·h)，無副產(chǎn)物生成[27]。這些酶在pH值、耐熱性方面與P.stutzeriL-RI相比有了明顯改善，且催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖的反應(yīng)過程中沒有副產(chǎn)物的生成，減少了下游分離產(chǎn)物和底物的成本，因此在生物轉(zhuǎn)化法工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛糖中具有巨大的潛力。

由于生物法生產(chǎn)D-阿洛糖的底物——D-阿洛酮糖本身是一種很有應(yīng)用前景的稀有糖，在食品、保健和醫(yī)療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值[28]，，因此將D-阿洛酮糖作為底物，生產(chǎn)代價過高，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。韓文佳等人提出的雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，即利用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPE)和L-鼠李糖異構(gòu)酶(L-RI)雙酶偶聯(lián)反應(yīng)，以2%的D-果糖為底物，反應(yīng)經(jīng)10 h達(dá)到平衡，得到D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的產(chǎn)量分別為5.12和2. 04 g/L，將果葡糖漿等富含果糖的低附加值原料轉(zhuǎn)化為含有功能性稀有糖的高附加值混合糖液，是D-阿洛糖工業(yè)化生產(chǎn)中降低底物成本的有效方案[36]。

5 研究展望

雖然L-RI在生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛糖中具有巨大的潛力，但要利用L-RI實現(xiàn)D-阿洛糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，還有一些技術(shù)和方法需要進(jìn)一步研究完善。

(1)分子改造方面。目前還沒有能在偏酸性范圍內(nèi)催化D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛糖的L-RI的報道，堿性的催化環(huán)境會增加底物的非特異性褐變，導(dǎo)致底物成本上升，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；另外，目前被報道的微生物來源的L-RI大多都呈現(xiàn)出嚴(yán)格的金屬離子依賴性，催化時都需要二價金屬離子的存在來保證最大酶活，而過多添加金屬離子不利于L-RI的實際生產(chǎn)應(yīng)用。

隨著L-RI 晶體結(jié)構(gòu)的解析，進(jìn)一步確定酶的反應(yīng)機制及酶活性中心的氨基酸，并根據(jù)活性中心氨基酸殘基及可能影響酶活性中心的氨基酸殘基, 選擇性地進(jìn)行定點突變設(shè)計以L-RI的最適pH以及減少L-RI對金屬離子的依賴性將對D-阿洛糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。

(2)L-RI的固定化研究。盡管已有些較成熟的L-RI 的固定化方法被建立，但由于被研究的L-RI種類及固定化方法有限，固定化L-RI生產(chǎn)對D-阿洛糖的研究仍具有很大的空間。新種屬酶或分子改造的優(yōu)質(zhì)酶的不斷涌現(xiàn)及新固定化方法的研究都將會使固定化L-RI生產(chǎn)D-阿洛糖的技術(shù)不斷創(chuàng)新。

(3)食品級基因工程菌的構(gòu)建與應(yīng)用。L-RI的食品級基因工程菌的研究仍然是L-RI研究中未涉足的領(lǐng)域，大腸桿菌仍然是目前用于表達(dá)L-RI的首選宿主，但D-阿洛糖作為一種新型的功能性稀有糖，用大腸桿菌作為宿主菌存在著安全隱患，因此L-RI食品級基因工程菌的構(gòu)建與應(yīng)用將成為新的研究熱點。