茅臺(tái)酒曲植物乳桿菌大豆酸面團(tuán)發(fā)酵面包的營(yíng)養(yǎng)與抗氧化特性

楊紫璇，張賓樂，蔣慧，馬子琳，武盟，徐巖,鄭建仙，黃衛(wèi)寧*，李寧，F(xiàn)ilip Arnaut

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)4(焙樂道食品集團(tuán)，比利時(shí) 布魯塞爾，B1702)

酸面團(tuán)作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵劑具有很多優(yōu)勢(shì)，能夠提高面包的比容、質(zhì)構(gòu)和口感，賦予面包特殊的風(fēng)味和抑制面包老化并延長(zhǎng)貨架期等[1]，同時(shí)在面包的營(yíng)養(yǎng)特性方面也有著積極的影響[2]。

大豆粉營(yíng)養(yǎng)成分(40%的蛋白質(zhì))豐富，將大豆粉添加到面包中勢(shì)必會(huì)增加面包的營(yíng)養(yǎng)。但是不經(jīng)過處理，很多營(yíng)養(yǎng)成分難以被消化、吸收和利用[3]。大豆中含有許多抗氧化活性成分如大豆異黃酮等。用大豆粉制作面包能很好的作為承載大豆異黃酮的食品[4]。乳酸菌發(fā)酵可以將生物利用率低的結(jié)合糖苷轉(zhuǎn)換為生物利用率高的游離苷元形式的異黃酮，提高人體吸收率[5-7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)不同菌種的乳酸菌發(fā)酵劑可顯著影響大豆粉酸面團(tuán)中的ACE-I活性及其乳化特性，通過篩選合適的乳酸菌菌株發(fā)酵可提高大豆粉酸面團(tuán)面包對(duì)人體健康的促進(jìn)作用[8]。乳酸桿菌屬是酸面團(tuán)中最為常見的菌屬[1]，而酒曲是目前分離篩選乳酸菌的重要來(lái)源之一。本研究采用大豆酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)制作大豆面包，測(cè)定了大豆酸面團(tuán)及面包的營(yíng)養(yǎng)與抗氧化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS 杭州百思生物技術(shù)有限公司; 福林-酚(Folin-Ciocalteu)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、維生素E(Trolox)：美國(guó)Sigma公司；沒食子酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃豆苷、黃豆苷元、染料木苷、金雀異黃酮，上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 面包粉，鵬泰(秦皇島)面粉有限公司;干酵母，法國(guó)樂斯福(上海)有限公司; 大豆粉，青島五谷康食品有限公司; 白砂糖、鹽、油，市售; 茅臺(tái)酒曲由江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造科學(xué)與酶技術(shù)中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-752 型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;TH-B-402無(wú)菌操作臺(tái)，無(wú)錫一凈凈化儀器設(shè)備廠; SPX-150C 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備; TDL-5離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠; SM-25攪拌機(jī)、SPC-40SP 醒發(fā)箱、SM-503烤箱，新麥機(jī)械(無(wú)錫)公司; Waters 600高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆酸面團(tuán)及其面包面團(tuán)制作

大豆面團(tuán)：大豆粉34 g，蔗糖6 g，自來(lái)水160 g(DY=500)。面團(tuán)攪拌均勻，不經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)直接制作面包。大豆酸面團(tuán)：大豆粉34 g，蔗糖6 g，自來(lái)水160 g(DY=500)。將產(chǎn)IA乳酸菌培養(yǎng)14 h，以達(dá)到產(chǎn)酶效率最高時(shí)期。取4支5 mL液體培養(yǎng)基菌液以保證面團(tuán)中乳酸菌起始接菌量為107CFU/g[9]。在5 000 r/min下離心10 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀2次。沉淀菌體用酸面團(tuán)制作中的水溶解并加入面團(tuán)中攪拌均勻，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)(160 r/min)36 h。面包配方見表1。

表1 小麥面包、大豆面包和大豆酸面團(tuán)面包配方Table 1 Formulations of wheat bread, soybean bread and soybean sourdough bread

注：由于大豆酸面團(tuán)pH值很低，所以向其中加入NaHCO32.2 g調(diào)節(jié)。

1.3.2 大豆異黃酮單體含量測(cè)定

大豆酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，從0 h開始，每隔3 h取1次樣，利用HPLC測(cè)定大豆酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離苷元型黃酮(IA)：大豆苷元、染料木黃酮；結(jié)合糖苷型黃酮(isoflavone glycoside，IG)：大豆苷、染料木苷的變化情況。面包樣品冷凍干燥后稱量。取樣品4 g與25 mL 100%甲醇混合均勻，并置于超聲波破碎,85%功率下萃取40 min，放入4 ℃的冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到容量瓶中并用甲醇定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜。色譜條件：C18柱(250 mm×4.5 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=30∶8∶62,用色譜級(jí)磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0，紫外260 nm下，流速1 mL/min，柱溫25 ℃[10]。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

首先，將1.3.2節(jié)中的酸面團(tuán)提取液200 μL(上清液)中加入2 mL蒸餾水、250 μL福林酚試劑和750 μL的Na2CO3(7%)。室溫下反應(yīng) 8 min 后加入 950 μL 蒸餾水，然后室溫下避光反應(yīng) 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，在765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。使用沒食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)?？偡雍?mg GAE/g)以沒食子酸當(dāng)量計(jì)算[11]。

1.3.4 大豆肽分子質(zhì)量分布

高效液相色譜法測(cè)定，以蒸餾水將酸面團(tuán)配成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣液，吸取2 mL樣液，過 0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜。用流動(dòng)相定容至100 mL。色譜條件:Waters600高效液相色譜儀;色譜柱:TSKgel2000SWXL體積排阻色譜柱(300 mm×7.8 mm);流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1；檢測(cè)：UV220 nm；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃。數(shù)據(jù)處理及計(jì)算由Waters M32GPC軟件自動(dòng)進(jìn)行[12]。

1.3.5 游離氨基酸含量

將制作好的面包樣品進(jìn)行冷凍干燥。準(zhǔn)確稱取干燥樣品1.000 g于容量瓶中，用0.5 g/mL 的三氯乙酸(TCA)定容至25 mL，超聲波破碎1 h，用雙層濾紙過濾。取濾液12 000 r/min離心30 min，取上清用鄰苯二甲醛進(jìn)行柱前衍生化。色譜條件：ODS Hypersil色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以20 mmol/L醋酸鈉的V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2溶液為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃[9]。

1.3.6 面包中抗氧化活性的測(cè)定

1.3.6.1 測(cè)定 DPPH 自由基清除能力

取1.3.2中的提取液100 μL與3.9 mL DPPH 溶液充分混合，避光30 min ，用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)Trolox計(jì)算樣品DPPH自由基清除能力[13]。

1.3.6.2 測(cè)定ABTS自由基清除能力

取1.3.2中的提取液50 μL與5.0 mL ABTS溶液中充分混合，避光10 min ，用分光光度計(jì)在734 nm下測(cè)定吸光度，樣品ABTS自由基清除能力計(jì)算同上步[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用ANONA方差分析顯著性，顯著性差異水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中4種大豆異黃酮單體變化

97%的大豆異黃酮都以結(jié)合的IG型式存在于大豆中，如大豆苷、染料木苷等。但I(xiàn)G不能發(fā)揮其功能活性，需經(jīng)過β-葡萄糖苷酶處理后變成IA型式的異黃酮，如大豆苷元、染料木素。IA型式的黃酮是脂溶性的，能被小腸上皮直接吸收，為人體直接利用，有良好的生物活性[14]。用能高產(chǎn)IA的乳酸菌發(fā)酵制作大豆酸面團(tuán)。大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素4種單體含量變化顯著(圖1)。相比發(fā)酵0 h的酸面團(tuán)，發(fā)酵36 h總IA含量增加了8.87倍。發(fā)酵0～6 h大豆苷以及染料木苷含量急劇下降，原因可能是此時(shí)乳酸菌正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的效率高，促進(jìn)IG形式轉(zhuǎn)化成IA型式。6 h后，2種IA含量均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，2種IG含量均呈現(xiàn)緩慢下降?？赡苁且?yàn)榫w在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸使pH降低，過低的pH會(huì)導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶酶活降低，進(jìn)而影響IG結(jié)構(gòu)向IA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。大豆酸面團(tuán)酚類物質(zhì)起到了抗氧化作用，而大豆異黃酮是其中主要的抗氧化物質(zhì)。IA的抗氧化能力高于IG[15]。瞿清燕等[9]接種了100株不同乳酸菌到豆乳中，測(cè)定最高的1株乳酸菌發(fā)酵后IA的總量是未發(fā)酵的8倍，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌。王欣欣等采用3種乳酸菌發(fā)酵黃漿水，其中戊糖片球菌水解IG的效率最高。發(fā)酵12 h后，IA從1.54 mg/L增加到16.89 mg/L，IG含量從73.76 mg/L減少至52.59 mg/L[16]。特定的乳酸菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生β3葡萄糖苷酶，水解結(jié)合型IG中的氧苷鍵，脫去連接的1分子葡萄糖基團(tuán)，使其轉(zhuǎn)化為游離型IA。

圖1 大豆酸面團(tuán)發(fā)酵過程中大豆異黃酮含量變化Fig.1 Changes of soybean isoflavone content during sourdough fermentation

2.2 酸面團(tuán)發(fā)酵過程中總酚含量變化

大豆酸面團(tuán)中總酚含量在發(fā)酵初期呈現(xiàn)一定程度的下降，隨后又呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)，這與徐春明[17]等研究結(jié)果類似，其研究表明總酚在納豆發(fā)酵過程中先降低后升高。發(fā)酵初期降低的原因可能是酸面團(tuán)中的水激活了大豆粉中的氧化酶系，使得酚被氧化，總酚含量降低。發(fā)酵后期(6 h后)乳酸菌分泌β-葡萄糖苷酶，將那些與糖和苷處于共軛結(jié)合狀態(tài)的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)釋放出來(lái)，變?yōu)橛坞x態(tài)酚，從而使總酚含量升高[18]。大豆酸面團(tuán)發(fā)酵前后大豆酸面團(tuán)中總酚含量從3.83 mg GAE/g提高到5.29 mg GAE/g。

圖2 大豆酸面團(tuán)發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.2 Changes of soybean total phenolic content during soybean sourdough fermentation

2.3 酸面團(tuán)發(fā)酵前后大豆肽分子質(zhì)量變化

大豆肽的分子質(zhì)量在10 kDa以下。本研究測(cè)定的大豆肽分子質(zhì)量主要分布在10 kDa以下，發(fā)酵后低分子質(zhì)量大豆肽的含量有顯著提升(如圖3所示)。

圖3 未發(fā)酵(a)及發(fā)酵36 h(b)大豆酸面團(tuán)蛋白肽分子質(zhì)量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution profile of unfermented(a) and 36 h fermented(b) soybean sourdough

可能原因是乳酸菌發(fā)酵期間會(huì)分泌蛋白酶，將大分子肽段降解為低分子肽段[19]。植物乳桿菌比干酪乳酸菌的蛋白水解能力更佳[20]。植物乳桿菌對(duì)蛋白酶反應(yīng)底物Succinyl-phe-pNA 具有較強(qiáng)的水解能力，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的蛋白酶活性。未發(fā)酵組大豆肽在分子質(zhì)量2 kDa左右的含量極少，占總體的2.90%，發(fā)酵36 h后提高到23.74%，是未發(fā)酵的8.2倍。并且分子質(zhì)量在10 kDa左右的多肽從70.66%下降到24.48%。沈蓓英[21]等將大豆多肽進(jìn)行酶解，得到具有最強(qiáng)的抗氧化活性的大豆肽分子質(zhì)量范圍為700～1 000 Da。研究表明大豆蛋白經(jīng)過水解后能產(chǎn)生抗氧化活性肽，這類肽能夠?qū)w系中自由基積累起到抑制作用，從而提高自由基的清除能力即抗氧化能力[22]。

表2 未發(fā)酵及發(fā)酵36 h大豆酸面團(tuán)蛋白肽分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of unfermented and 36 h fermented soybean sourdough

2.4 面包中游離氨基酸含量

圖5對(duì)比了3種面包中18種游離氨基酸組成。將大豆粉引入大豆面包(SB)中后，總游離氨基酸含量為63.38 mg/100 g面包，顯著高于小麥面包(WB)45.11 mg/100 g。除Ser、Lys、Pro以外SB中其他氨基酸均高于WB。

圖5 小麥面包、大豆面包和大豆酸面團(tuán)面包中游離氨基酸含量Fig.5 Free amino acid content of wheat bread, soybean bread and soybean sourdough bread

大豆酸面團(tuán)面包(SSB)中總游離氨基酸含量為128.06 mg/100 g是SB的2.02倍，引起這種變化的原因是酸面團(tuán)發(fā)酵后，大豆酸面團(tuán)游離氨基酸含量大幅度上升，用于面包制作后使面包的氨基酸含量大幅度上升，其中Phe、Val、Lys、Asp、Arg這幾種含量上升幅度較其他氨基酸更高。有研究表明Lys和Arg可以與不飽和脂肪酸反應(yīng)生成鹽，從而抑制氧化[23]。

2.5 面包中大豆異黃酮含量

大豆面包中的結(jié)合型糖苷(IG)總量為8.93 mg/100 g面包，顯著高于游離型苷元(IA)總量2.18 mg/100 g面包，與未發(fā)酵的大豆面團(tuán)相類似，制作成面包后IA的比例有所上升，IG比例有所下降。發(fā)酵后的大豆酸面團(tuán)面包中IG總量為5.72 mg/100 g面包，IA總量為6.39 mg/100 g面包。大豆酸面團(tuán)面包中IA總量是大豆面包中IA總量2.93倍。說(shuō)明酸面團(tuán)制作可以使面包中IA顯著提高。OTIENO等利用嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆?jié){，豆?jié){中苷元型大豆異黃酮經(jīng)24 h發(fā)酵后從8%增加至76.8%[24]。DAE等研究發(fā)現(xiàn)豆乳發(fā)酵后IA結(jié)構(gòu)增加的數(shù)量無(wú)法達(dá)到IG結(jié)構(gòu)減少的數(shù)量，且相差巨大。說(shuō)明在發(fā)酵過程中IA與IG之間并不是完全的轉(zhuǎn)化關(guān)系[25]。

表3 小麥面包、大豆面包和大豆酸面團(tuán)面包的大豆異黃酮含量Table 3 Free soybean isoflavone content in wheat bread, soybean bread and soybean sourdough bread

2.6 面包抗氧化特性

特定的乳酸菌發(fā)酵可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，將結(jié)合型IG異黃酮轉(zhuǎn)化成抗氧化活性更高的游離IA型異黃酮(黃豆苷元和染料木黃酮)，游離的苷元具有更廣泛、更強(qiáng)烈的生物學(xué)活性[27]。并且大豆酸面團(tuán)中總酚含量也有所上升。研究表明乳酸菌發(fā)酵能夠釋放一些不溶性酚類，并使其降解成為活性更高的抗氧化物，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，因此采用乳酸菌發(fā)酵能夠改善高溫烘焙制品如面包等的抗氧化活性[28]。具有較高的抗氧化活性的疏水氨基酸殘基都隱藏在蛋白質(zhì)大分子的內(nèi)部，很難與外界接觸發(fā)揮作用。發(fā)酵后蛋白肽鍵被切斷，可使其抗氧化活性基團(tuán)充分暴露；經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，大豆蛋白肽鍵斷裂，氨基酸釋放，抗氧化作用得到進(jìn)一步提升。這個(gè)結(jié)果也與LI等人的研究相似，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆制品中分離的植物乳桿菌具有DPPH自由基、羥基自由基清除能力，以及過氧化氫抑制能力[29]。

圖6 不同面包的DPPH和ABTS自由基清除能力Fig.6 The DPPH and ABTS radical-scavenging activity of different breads

3 結(jié)論

大豆酸面團(tuán)發(fā)酵過程中游離型大豆異黃酮苷元含量顯著提高。發(fā)酵使總酚含量從3.83 mg GAE/g提高到5.29 mg GAE/g。發(fā)酵36 h的酸面團(tuán)中分子量2 kDa以下的抗氧化活性肽比未發(fā)酵組含量提高了8.2倍。相比于小麥面包與大豆面包，大豆酸面團(tuán)面包在游離氨基酸、游離型大豆異黃酮含量上顯著提升，DPPH抗氧化能力分別是前兩者的12.6倍和3.0倍；ABTS抗氧化能力分別是前兩者的4.4倍和1.3倍。大豆酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)有助于改善其面團(tuán)及面包的營(yíng)養(yǎng)及抗氧化能力。