Clostridium clariflavum GH10木聚糖酶的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及位點(diǎn)功能分析

王華廣，劉雨露，胡方覬，唐蕾,2*

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

木質(zhì)纖維素是豐富的可再生生物質(zhì)資源，占地球所有可再生有機(jī)碳的1/3[1]。目前這部分潛在資源并未被有效開發(fā)利用，造成了生物質(zhì)資源的極大浪費(fèi)[2]。木聚糖是半纖維素的主要成分，如何降解木聚糖是利用半纖維素生物質(zhì)資源的關(guān)鍵。木聚糖酶可以水解木聚糖中的糖苷鍵，把木聚糖降解成木糖或者低聚木糖。大多數(shù)木聚糖為雜多糖側(cè)鏈上含有不同的基團(tuán)，如阿拉伯糖、乙?；?、阿魏酸殘基、4-O甲基葡萄糖醛酸基等[3]。因此完全水解木聚糖需要多種酶的共同作用，其中起重要作用的是β-1,4內(nèi)切木聚糖酶。生物酶法催化有效率高和環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)應(yīng)用中正在取代化學(xué)催化法。木聚糖酶主要應(yīng)用在紡織、食品、飼料、造紙、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化等工業(yè)方面[4]。由于不同應(yīng)用環(huán)境對酶有不同的要求，因此開發(fā)出適用于不同用途的木聚糖酶非常必要，目前采取的手段包括新酶的挖掘和酶的分子改造[5-7]。

根據(jù)蛋白的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特征、底物的特異性、作用機(jī)制等理化性質(zhì)的不同，木聚糖酶可分為6個糖苷水解酶家族：GH5、GH8、GH10、GH11、GH30、GH43，大多數(shù)木聚糖酶屬于GH10和GH11[8-9]。GH10家族木聚糖酶具有較大的分子質(zhì)量(>30 kDa)、低等點(diǎn)電、廣泛的底物特異性、典型的(β/α)8桶折疊結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)[5,10]，是近幾年來研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)之一，如GH10家族新酶的尋找、非理性改造、理性設(shè)計(jì)、結(jié)構(gòu)解析、作用機(jī)制、末端氨基酸的作用等方面[11-16]。

Clostridiumclariflavum是一種新發(fā)現(xiàn)的嗜熱厭氧木質(zhì)纖維素降解菌，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)表明，C.clariflavum菌擁有豐富的木質(zhì)纖維素降解酶系種類，在木質(zhì)纖維素的降解方面有廣泛的應(yīng)用潛力[17]。目前關(guān)于此菌來源的重組酶在國內(nèi)外的研究鮮有報(bào)道。本課題組之前首次在大腸桿菌中克隆表達(dá)了C.clariflavum的一個雙催化域木聚糖酶基因Clocl-2441(結(jié)構(gòu)域?yàn)镚H11-CBM6-DockerinI-GHl0)，并初步研究了其酶學(xué)性質(zhì)[18]。本研究將Clocl-2441中的單個GH10結(jié)構(gòu)域構(gòu)建到pET28a(+)載體上，研究其酶學(xué)性質(zhì)，并通過分子改造發(fā)現(xiàn)209位點(diǎn)的組氨酸是酶活性的重要氨基酸，研究結(jié)果為具有雙催化域的木聚糖酶的分子改造和應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) JMl09、BL21(DE3)宿主菌株以及pET28a(+)、pET28a(+)-2441質(zhì)粒均為實(shí)驗(yàn)室所保藏。

1.1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶(EcoR I，Hind III)、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白定量試劑盒，均購自TaKaRa(大連)。山毛櫸木聚糖購自愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

重組木聚糖酶rXyn2441GH10的基因來自先前實(shí)驗(yàn)室保存的含有C.clariflavum的一個雙催化域木聚糖酶基因Clocl-2441的重組質(zhì)粒pET28a(+)-2441[18]。通過NCBI結(jié)構(gòu)域序列分析將其中完整的GH10結(jié)構(gòu)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物為：CCGGAATTCATTCCCTGCAGAAAATAATACAC，下游引物為：CCCAAGCTTCATTAATATTTCTTTCAATGCGTTG，擴(kuò)增產(chǎn)物含有1 062 bp，表達(dá)蛋白含有353個氨基酸。以pET28a(+)-2441重組質(zhì)粒為模板，利用PrimeSTAR MaxDNA Polymerase高保真DNA聚合酶擴(kuò)增出完整目的基因片段。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，34個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 重組載體pET28a-Xyn2441GH10的構(gòu)建

將保藏的含有pET28a(+)質(zhì)粒的JM109菌株培養(yǎng)12～14 h后提取質(zhì)粒。將擴(kuò)增的目的產(chǎn)物片段和空載質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III在37 ℃下反應(yīng)1 h，將雙酶切產(chǎn)物膠回收后測定核酸含量和純度。把載體和目的片段以1∶8的比例用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的重組子均勻涂布到含有100 μg/mL的卡那霉素固體LB培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)后測序驗(yàn)證。

1.2.3 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將構(gòu)建好的重組菌于37 ℃、200 r/min搖床上過夜培養(yǎng)，以4%的體積分?jǐn)?shù)接種量轉(zhuǎn)接入含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.4 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)，25 ℃、200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)10 h，離心收集菌體。將收集的菌體用磷酸緩沖液重新懸浮進(jìn)行超聲破碎,離心收集上清，粗酶液用0.22 μm水系濾膜過濾后通過1 mL鎳柱進(jìn)行純化(GE公司his-TrapTMHP)。把有酶活性的洗脫峰通過脫鹽柱(Sephadex G25)進(jìn)行脫鹽，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl-sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳鑒定純度，測定蛋白量和酶活。

1.2.4 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的活性測定

將10 mg/mL的木聚糖底物與梯度稀釋后的酶液反應(yīng)10 min后，用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)法測定還原糖(以木糖計(jì))[19]。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖量和相應(yīng)的酶活性(3個平行取平均值)。酶活單位定義為:每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1 U。

1.2.5 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.5.1 最適溫度

在0.1 mol的磷酸緩沖溶液(pH 6.5)條件下，45～85 ℃范圍內(nèi)(梯度為5 ℃)檢測酶活性，以最高酶活為100%計(jì)算相對酶活。

1.2.5.2 最適pH

在pH 5.0～8.0(梯度為0.5)緩沖溶液和最適溫度條件下檢測不同pH下的酶活，以最高酶活為100%計(jì)算相對酶活。

1.2.5.3 溫度穩(wěn)定性

將蛋白質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL的酶液，在55、60、65、70 ℃下處理不同的時(shí)間，在最適溫度和pH下檢測剩余酶活，以處理0 h的酶活為100%計(jì)算處理不同時(shí)間的剩余酶活。

1.2.5.4 pH穩(wěn)定性

將酶液在pH 3.0～9.0范圍的緩沖溶液中于20 ℃下處理5 h，在最適條件下測定其剩余酶活，以未處理的酶活為100%計(jì)算不同pH處理后剩余酶活。

1.2.5.5 金屬離子及EDTA對重組木聚糖酶活性的影響

以Tris-HCl緩沖液配置不同金屬離子母液，按需添加至稀釋后的酶液中，分別考察了1 mmol/L和 5 mmol/L的 KCl、LiCl、CoCl2、MgCl2、MnCl2、CaCl2、FeCl3、AlCl3和EDTA 對rXyn2441GH10酶活的影響。在最適條件下檢測酶活，以未添加金屬離子和EDTA的酶活為100%計(jì)算酶活的變化。

1.2.6 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的動力學(xué)參數(shù)測定

在酶的最適條件下測定不同底物濃度下的初始酶活，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖。以底物1/[S]為X軸，1/[V]為Y軸作圖擬合出線性方程，計(jì)算不同底物的Km和Vmax以及其他參數(shù)。

1.2.7 重組木聚糖酶GH10結(jié)構(gòu)域209位點(diǎn)飽和突變

通過全質(zhì)粒PCR來引入19種氨基酸突變，在引物上設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)以重組質(zhì)粒為模板通過高保真酶擴(kuò)增質(zhì)粒全長，DpnI酶消化PCR產(chǎn)物去除模板后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)。挑選重組子測序確定正確的突變菌株。突變體菌株和rXyn2441GH10菌株在相同的條件(同1.2.3)誘導(dǎo)表達(dá)，控制菌體收集量一致，在相同的條件下測定rXyn2441GH10和突變酶的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以含有rXyn2441GH10木聚糖酶基因的質(zhì)粒pET28a(+)-2441為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示，目的基因條帶單一，與理論1 062 bp大小符合(圖1)。

圖1 目的基因Xyn2441GH10的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of gene Xyn2441GH10

EcoR I和Hind III雙酶切法將擴(kuò)增的目的基因插入pET28a(+)載體上。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，雙酶切重組質(zhì)粒后通過電泳驗(yàn)證(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-Xyn2441GH10的雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Validation of recombinant plasmid by double enzyme digestion

1泳道有2條條帶，第1條與載體大小符合；第2條與Xyn2441GH10基因理論大小1 062 bp符合，說明基因成功插入正確位點(diǎn)。將菌液樣品送至華大基因測序。測序結(jié)果顯示，插入的基因序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)上公布的C.clariflavumDSM 19732基因Clocl-2441序列( ID：11562857)的GH10結(jié)構(gòu)域基因序列完全一致，且讀碼框正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組木聚糖酶的GH10結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與不同種屬來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列用DNAMAN比對分析，結(jié)果表明不同種屬來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列比較保守，相似度為64.01%。GH10木聚糖酶在N末端的氨基酸的保守性較低比較靈活，相比之下C末端和中間部分氨基端保守性較強(qiáng)(圖3)。

1-Clostridium clariflavum; 2-Clostridium thermocellum; 3-Actinomadura meyerae; 4-Streptomyces olivaceoviridis; 5-Thermotoga maritime，黑色倒三角標(biāo)示出推測的129位和240位催化氨基酸，黑色箭頭標(biāo)示出209位點(diǎn)的組氨酸圖3 不同來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of GH10 xylanase from different sources

2.2 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將重組E.coliBL21(pET28a-Xyn2441GH10)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)分離純化(方法1.2.3)。把分別含有pET28a(+)的大腸桿菌、pET28a-Xyn2441GH10未誘導(dǎo)大腸桿菌、pET28a-Xyn2441GH10誘導(dǎo)后大腸桿菌上清酶液以及純化后酶液，取相同蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。對比空質(zhì)粒(1泳道)、重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)(2泳道)、重組質(zhì)粒誘導(dǎo)(3泳道)發(fā)現(xiàn)：第3泳道在44.3 kDa處有明顯的蛋白條帶與重組木聚糖酶理論大小43.8 kDa符合，表明目的蛋白成功表達(dá)并且為可溶性蛋白(圖4)。經(jīng)過鎳柱純化和脫鹽處理后rXyn2441GH10達(dá)到了電泳純，可進(jìn)行進(jìn)一步的酶學(xué)性質(zhì)分析。

M-marker; 1-pET28a(+); 2-pET28a-Xyn2441GH10 (-IPTG); 3-pET28a-Xyn2441GH10 (+0.4 mmol/L IPTG); 4-pET28a-Xyn2441GH10 (純化后)圖4 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of recombinant xylanase rXyn2441GH10

2.3 木聚糖酶rXyn2441GH10的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適溫度

最適反應(yīng)溫度結(jié)果如圖5所示。rXyn2441GH10的最適反應(yīng)溫度是70 ℃，與rXyn2441最適溫度相同[18]。

圖5 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的最適溫度Fig.5 The optimal reaction temperature for recombinant xylanase rXyn2441GH10

rXyn2441GH10在60 ～75 ℃之間酶活比較高，75 ℃以上酶活急劇下降，85 ℃時(shí)酶活僅為70 ℃時(shí)的19%，rXyn2441GH10屬于嗜熱木聚糖。如表1所示，大多數(shù)GH10木聚糖酶最適溫度在45 ～80 ℃之間，rXyn2441GH10木聚糖酶的最適溫度較高，為在較高溫度環(huán)境下的應(yīng)用提供了新選擇。

2.3.2 最適pH值

最適反應(yīng)pH結(jié)果如圖6所示。rXyn2441GH10的最適反應(yīng)pH是7.0，在pH 6.0～7.5之間酶活為最適酶活的70%以上，在pH值小于5.5時(shí)其酶活下降較快，pH 5.0時(shí)的酶活僅為最適酶活的20%，屬于中性木聚糖酶。與rXyn2441的最適pH相比提高了0.5，雙結(jié)構(gòu)域的最適pH不同可能是導(dǎo)致pH不同的原因[18]。不同來源的GH10木聚糖酶最適pH分布比較廣泛，大多在pH 4.0～9.0之間，rXyn2441GH10適合在pH 6.0～7.5 的環(huán)境中應(yīng)用(表1)。

圖6 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的最適pHFig.6 The optimal reaction pH for recombinant xylanase rXyn2441GH10

2.3.3 溫度穩(wěn)定性

溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示。rXyn2441GH10在60 ℃及以下很穩(wěn)定，在55、60 ℃處理6 h后剩余酶活為初始酶活的90%以上。rXyn2441GH10在65 ℃相比60 ℃穩(wěn)定性有所下降，在處理6 h后酶活為初始酶活的38%。rXyn2441GH10在70 ℃下熱穩(wěn)定性明顯降低，在處理1 h后酶活僅為初始酶活的17%。結(jié)果表明rXyn2441GH10在60 ℃及以下比較穩(wěn)定，在70 ℃以及以上酶活穩(wěn)定性降低。與多數(shù)不同來源的GH10木聚糖酶相比，rXyn2441GH10在65 ℃以下穩(wěn)定性更強(qiáng)(表1)。

圖7 重組木聚糖酶rXyn2441GH10的溫度穩(wěn)定性Fig.7 The thermostability for recombinant xylanase rXyn2441GH10

2.3.4 pH穩(wěn)定性

pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖8所示。rXyn2441GH10在pH 4.0～9.0之間都比較穩(wěn)定，在該條件下處理5 h后其剩余酶活在84%以上。在pH 3.0環(huán)境下處理5 h后剩余酶活急劇下降僅為初始酶活的22%，有可能在該pH下對酶活性中心影響很大。rXyn2441GH10在中性偏酸性的環(huán)境下pH穩(wěn)定性最好，與已知的GH10木聚糖酶相比pH穩(wěn)定性范圍更寬，適合的應(yīng)用范圍更廣泛(表1)。

2.3.5 金屬離子和EDTA對rXyn2441GH10的影響

結(jié)果如表2所示。K+、Ca2+、Mg2+、Al3+和Fe3+對rXyn2441GH10酶活有促進(jìn)作用，其中5 mmol/L的Mg2+使的酶活提高了79.2%。Li+、Co2+和Mn2+對酶活有抑制作用，5 mmol的Co2+使酶活降低到58.3%。EDTA對酶活有微弱的促進(jìn)作用。其中較高的金屬離子濃度對rXyn2441GH10影響比較大，與NCBI數(shù)據(jù)表明蛋白存在較多金屬離子結(jié)合位點(diǎn)一致[20]，可能是金屬離子與酶的結(jié)合進(jìn)而影響了其的活性。以上結(jié)果對rXyn2441GH10的應(yīng)用有重要的指導(dǎo)作用。

2.4 rXyn2441GH10的動力學(xué)參數(shù)

通過1.2.6方法測定數(shù)據(jù)用Origin 9.0作圖擬合線性方程，櫸木木聚糖底物擬合方程是Y=0.001 5X+0.000 591(R2=0.992)，甘蔗渣木聚糖底物擬合方程是Y=0.001 6X+0.001 7(R2=0.992)。根據(jù)線性方程計(jì)算動力學(xué)參數(shù)(表3)，相比之下重組酶水解櫸木木聚糖效率更高，且與文獻(xiàn)總結(jié)的不同來源的GH10木聚糖酶相比有更大的Vmax和kcat，但對羧甲基纖維素鈉沒有活性，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[21-22]。

2.5 重組木聚糖酶209位點(diǎn)組氨酸的定點(diǎn)飽和突變

通過全質(zhì)粒PCR引入突變的方法，將209位點(diǎn)的組氨酸突變成其他19種氨基酸。測序結(jié)果比對分析表明，209位點(diǎn)的組氨酸被成功突變成19種氨基酸。測定rXyn2441GH10和突變酶的酶活，以rXyn2441GH10酶活為100%作圖，結(jié)果表明19個突變體對山毛櫸木聚糖降解活性喪失或者幾近喪失，活性最高的突變體H209S僅為rXyn2441GH10的0.17%(圖9)。說明209位點(diǎn)的組氨酸對酶活性有很大的影響。

表3 重組木聚糖酶rXyn2441GH10動力學(xué)參數(shù)Table 3 The kinetic parameters of the recombinant xylanase rXyn2441GH10

圖9 rXyn2441GH10的209位點(diǎn)飽和突變對酶活性的影響Fig.9 Effect of 209 site-saturation mutagenesis on activity of the recombinant xylanase rXyn2441GH10

為了研究突變體酶活變化是不是二級結(jié)構(gòu)變化引起的，通過圓二色性光譜分析了H209N突變體和rXyn2441GH10的二級結(jié)構(gòu)(圖10)。

圖10 重組木聚糖酶rXyn2441GH10和H209N突變酶的圓二色性光譜Fig.10 The circular dichromatic spectrum of recombinant xylanase rXyn2441GH10 and its H209N mutant

結(jié)果表明，H209N突變體和rXyn2441GH10在二級結(jié)構(gòu)上沒有發(fā)生變化，突變后酶活的變化不是二級結(jié)構(gòu)變化引起的。將不同來源的GH10木聚糖酶的氨基酸序列比對分析(圖3)，箭頭標(biāo)注的組氨酸和倒三角標(biāo)注的2個谷氨酸在所有GH10結(jié)構(gòu)域中非常保守，且這3個氨基酸周圍的氨基酸同樣很保守。rXyn2441GH10與同屬菌Clostridiumthermocellum來源的GH10木聚糖酶XynZ氨基酸序列相似度為63%，且XynZ晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析。在XynZ中2個保守的谷氨酸為催化氨基酸，209位點(diǎn)的組氨酸在結(jié)構(gòu)中位于酶的催化裂口處，與2個催化氨基酸Glu相鄰可與催化殘基產(chǎn)生氫鍵作用，使得2個谷氨酸在空間結(jié)構(gòu)保持異頭構(gòu)象完成催化[23]。在rXyn2441GH10中209位點(diǎn)的His有可能起到類似的作用，209位點(diǎn)突變成其他的氨基酸后導(dǎo)致異頭構(gòu)象不穩(wěn)定使得催化效率大大降低甚至喪失。

3 結(jié)論

Clostridiumclariflavum菌株可產(chǎn)生多種木質(zhì)纖維素降解酶類，在木質(zhì)纖維素降解方面有廣泛的應(yīng)用潛力。目前國外對C.clariflavum菌株來源的木質(zhì)纖維素降解酶類主要關(guān)注在以纖維小體為中心的復(fù)合酶的作用機(jī)制以及應(yīng)用，但對單個酶或單個結(jié)構(gòu)域性質(zhì)研究很少，對工業(yè)應(yīng)用指導(dǎo)作用有限[18,24]。本實(shí)驗(yàn)成功克隆了Clocl-2441上GH10結(jié)構(gòu)域木聚糖酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)為可溶性蛋白。酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃，最適pH值為7.0，屬于中性嗜熱木聚糖酶。rXyn2441GH10適合在55～65 ℃、pH 6.0～7.5條件下應(yīng)用，與已報(bào)道的部分GH10木聚糖酶相比具有更廣泛的應(yīng)用適應(yīng)性。209位點(diǎn)的組氨酸是rXyn2441GH10活性的關(guān)鍵氨基酸，并且在GH10結(jié)構(gòu)域中極其保守，對GH10木聚糖酶的位點(diǎn)分析和改造有指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果為重組GH10木聚糖酶的研究及工業(yè)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。