人附睪蛋白4對(duì)上皮性卵巢癌的早期診斷價(jià)值

袁　捷，陳　靜

(1.吉安市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 吉安 343000；2.吉安市白塘街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心婦產(chǎn)科，江西 吉安 343000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占卵巢癌的60%左右，其發(fā)病率和死亡率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[1]。由于EOC早期階段(Ⅰ～Ⅱ期)無(wú)典型的臨床表觀，大多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期階段，這也是EOC高死亡率的主要原因[2-3]。目前，臨床上對(duì)EOC的早期診斷主要借助于常規(guī)超聲篩查及血清CA125檢測(cè)等手段，但因CA125敏感性和特異性低，導(dǎo)致診斷假陰率較高，聯(lián)合超聲檢測(cè)陽(yáng)性診斷率也低于20%[4]。晚期EOC患者5 a死亡率約為早期患者的3倍，高達(dá)70%～80%，且EOC的發(fā)病率和死亡率正呈逐年上升趨勢(shì)[5-6]。因此，越來(lái)越多的專(zhuān)家和學(xué)者正致力于研究一種高敏感性和特異性的新型EOC早期診斷方法。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)可能是一類(lèi)與精子成熟相關(guān)的蛋白酶抑制劑，功能尚不清楚。HE4基因表達(dá)與卵巢癌相關(guān)，因其可作為EOC診斷的一類(lèi)特異性腫瘤標(biāo)志物而引起廣泛重視和研究[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)HE4與EOC早期診斷方面的研究主要集中于血清學(xué)方面，而關(guān)于卵巢組織中特異性表達(dá)HE4的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)檢測(cè)患者血清HE4水平，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)方法探討卵巢組織中HE4基因表達(dá)情況與血清HE4水平之間的關(guān)系，這將為HE4在EOC早期診斷中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集我院及江蘇省人民醫(yī)院于2013年3月至2016年3月期間經(jīng)病理學(xué)檢查確診為EOC的患者100例(EOC組)，年齡20～69(51.17±12.28)歲；早期(Ⅰ～Ⅱ期)EOC患者44例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)EOC患者56例；組織學(xué)類(lèi)型：漿液性腺癌43例，黏液性腺癌57例；組織分化程度：中、低分化73例，高分化27例。選取同期收治的良性卵巢腫瘤患者35例(良性對(duì)照組)和卵巢非腫瘤性疾病患者30例(正常對(duì)照組)。良性對(duì)照組患者年齡23～68(52.52±14.25)歲。正常對(duì)照組患者年齡24～63(51.25±15.27)歲。收集患者年齡、FIGO分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料，其中部分EOC患者和卵巢非腫瘤性疾病患者信息樣本由江蘇省人民醫(yī)院收集。其中正常對(duì)照組標(biāo)本取自絕經(jīng)宮頸癌患者手術(shù)治療同期切除的正常卵巢組織，良性對(duì)照組標(biāo)本取自卵巢囊腫和肌瘤患者手術(shù)切除的良性卵巢腫瘤組織。入組患者排除重癥內(nèi)科疾病，既往無(wú)其他惡性腫瘤史，首次治療切除卵巢組織前均未接受放療或化療。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器HE4定量檢測(cè)試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)和全自動(dòng)免疫分析儀均購(gòu)自德國(guó)Roch公司。RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，上下游引物由美國(guó)Invitrogen公司合成，一步法qPCR試劑盒和Smart SpecTMPlus核酸蛋白測(cè)定儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。高速組織勻漿機(jī)購(gòu)自德國(guó)IKA公司。Step One PlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清HE4水平所有患者于住院治療期間進(jìn)行空腹靜脈采血，血液樣本在4 h內(nèi)離心分離，收集血清放于-80 ℃冰箱保存。行化學(xué)發(fā)光前，所有樣本低溫解凍，并按檢測(cè)試劑盒和儀器操作步驟進(jìn)行。樣本溶解后于4 ℃低溫保藏，并于48 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。HE4的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)項(xiàng)目參考范圍為0～140 pmol·L-1，>140 pmol·L-1則記為陽(yáng)性。

1.4qPCR檢測(cè)HE4mRNA表達(dá)卵巢組織經(jīng)高速組織勻漿機(jī)低溫勻漿并提取組織RNA，應(yīng)用核酸定量?jī)x定量后控制RNA濃度在2.0 μg·L-1。一步法qPCR擴(kuò)增體系配制如下：RNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR?Green Mix 10 μL，iScript逆轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，無(wú)核酶水6.95 μL，總體系為20 μL。程序設(shè)定如下：50 ℃，10 min行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95 ℃，60 s預(yù)變性；95 ℃，15 s變性，60 ℃，60 s退火，共36個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置，數(shù)據(jù)處理方法采用2-ΔΔCT相對(duì)定量法。

2　結(jié)果

2.1各組患者血清HE4陽(yáng)性率比較各組患者血清HE4陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常對(duì)照組、良性對(duì)照組和EOC組患者血清HE4陽(yáng)性率分別為0.00%(0/30)、17.14%(6/35)和75.00%(75/100)，EOC組的陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組和良性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組患者血清HE4陽(yáng)性率比較

2.2EOC患者血清HE4陽(yáng)性率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系晚期患者HE4陽(yáng)性率顯著高于早期患者(P<0.05)。中、低分化患者HE4陽(yáng)性率顯著高于高分化患者(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HE4陽(yáng)性率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　EOC患者血清HE4陽(yáng)性率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3各組患者卵巢組織中HE4mRNA的表達(dá)情況比較各組患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EOC組患者卵巢組織中HE4 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組和良性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　各組患者卵巢組織中HE4 mRNA表達(dá)的比較

2.4EOC患者卵巢組織中HE4mRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系與早期患者相比，晚期患者卵巢組織中HE4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。中、低分化患者HE4 mRNA水平顯著高于高分化患者(P<0.05)。同時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者HE4 mRNA水平也均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。但卵巢組織中HE4 mRNA的表達(dá)均與患者年齡和組織分型無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4　EOC患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3　討論

目前，臨床上常規(guī)借助CA125聯(lián)合超聲篩查等手段用于EOC早期診斷，但CA125存在敏感性差和組織特異性低等制約因素[4]。研究[4]顯示，在EOC患者中，約20%的群體不表達(dá)或低表達(dá)CA125，且我院往期收治患者中也出現(xiàn)部分CA125假陽(yáng)性結(jié)果，往往因患者存在個(gè)體差異及良性腫瘤等影響因素，導(dǎo)致常規(guī)診斷手段的EOC診斷率較低。本文所研究的HE4是一類(lèi)與生殖相關(guān)的蛋白酶抑制劑類(lèi)物質(zhì)，其本質(zhì)上是一種分泌型糖蛋白，但生物學(xué)功能目前尚不清楚[7-8]。已有研究[9]證實(shí)HE4與卵巢癌病理生理過(guò)程相關(guān)。本研究檢測(cè)患者血清中的HE4水平后發(fā)現(xiàn)，EOC患者血清中HE4陽(yáng)性率顯著高于良性對(duì)照組和正常對(duì)照組，表明EOC患者體內(nèi)高表達(dá)和分泌HE4。尤其在正常對(duì)照組中無(wú)HE4陽(yáng)性患者，良性對(duì)照組HE4陽(yáng)性率也未超過(guò)20%，這進(jìn)一步提示患者血清中HE4水平變化可能與卵巢組織癌變有關(guān)。

由于HE4是一種分泌型糖蛋白，不利于組織原位檢測(cè)[7-8]。因此，為了進(jìn)一步探討患者血清HE4水平與卵巢癌變之間的可能性關(guān)系，本研究利用qPCR方法檢測(cè)了3組患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示EOC患者卵巢組織中HE4 mRNA的表達(dá)顯著高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，表明卵巢癌變可引起組織中HE4 mRNA表達(dá)上調(diào)，這也與HE4在卵巢癌細(xì)胞系中高表達(dá)的研究結(jié)果相一致[10]。有研究[11]顯示，HE4在人體正常卵巢組織中不表達(dá)或低表達(dá)，結(jié)合血清HE4檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步提示卵巢癌變導(dǎo)致組織中的HE4 mRNA表達(dá)上調(diào)，可能進(jìn)一步促進(jìn)了HE4蛋白的合成和分泌過(guò)程。

從EOC患者血清HE4水平和mRNA檢測(cè)結(jié)果與臨床病理參數(shù)的關(guān)系可以看出，以上HE4檢測(cè)指標(biāo)均與臨床分期、細(xì)胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，這進(jìn)一步說(shuō)明HE4在EOC的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中扮演一定的角色。同時(shí)，HE4具有較強(qiáng)的組織特異性，可彌補(bǔ)常規(guī)CA125篩查導(dǎo)致的假陰性較高缺陷，因此推測(cè)HE4檢測(cè)指標(biāo)可用于EOC的篩查和診斷。

本研究結(jié)合qPCR等分子生物學(xué)方法，探討了血清HE4與卵巢組織中HE4基因表達(dá)的可能性關(guān)系，這為研究HE4在EOC組織中特異性表達(dá)及血清HE4檢測(cè)指標(biāo)用于EOC的早期診斷等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。