活菌制劑和復(fù)合酶制劑對(duì)青貯玉米秸稈化學(xué)組成及纖維微觀結(jié)構(gòu)的影響

毛建紅　陶　蓮　劉　融　王玉榮　許貴善　刁其玉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300)

我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈資源豐富，特別是玉米秸稈，是反芻動(dòng)物重要的粗飼料來源之一。秸稈細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、部分果膠等其他化學(xué)成分組成，其中纖維素占據(jù)整個(gè)細(xì)胞壁的30%～50%，是反芻動(dòng)物可以直接利用的碳源[1]。但是秸稈細(xì)胞壁中，木質(zhì)素作為一種芳香族高分子化合物，與半纖維素形成穩(wěn)定的木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體，將纖維素和半纖維素包裹其中，使瘤胃微生物與纖維素降解酶不能直接接觸纖維素，如能有效破解秸稈細(xì)胞壁復(fù)合體結(jié)構(gòu)，則可以提高生物制劑的作用效果，從而提高秸稈的利用率[2-3]。因此，對(duì)秸稈進(jìn)行破壁處理，是提高秸稈飼料化利用率的關(guān)鍵步驟，其主要目的是破解或去除秸稈中的抗?fàn)I養(yǎng)結(jié)構(gòu)，增加微生物與酶的可及性，提高纖維素的降解速率和轉(zhuǎn)化率[4]。纖維素具有特定的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，分別用聚合度、氫鍵作用力、結(jié)晶度和比表面積進(jìn)行表征，而表征指標(biāo)的變化則可以代表纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而代表秸稈被降解的程度[5]。目前，大部分學(xué)者主要是以改善秸稈營養(yǎng)品質(zhì)、提高秸稈飼料利用率為研究重點(diǎn)，但是在秸稈生物處理過程中，秸稈細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu)的破解程度與秸稈主要纖維成分，如中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、纖維素、半纖維素的相關(guān)卻鮮有報(bào)道。觀察并分析秸稈細(xì)胞壁的纖維形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)，可以從分子水平揭示秸稈飼料化的作用機(jī)制，對(duì)評(píng)價(jià)秸稈飼料的營養(yǎng)價(jià)值具有很大的作用。因此，本研究以玉米秸稈為試驗(yàn)材料，研究生物發(fā)酵前后秸稈的營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)和纖維微觀結(jié)構(gòu)變化，旨在為秸稈飼料化利用的技術(shù)提供支撐。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

玉米秸稈取自河北省保定市，品種為金玉99，于2016年9月收獲籽實(shí)后收割。采集的玉米秸稈經(jīng)65 ℃烘干48 h后，混合均勻，粉碎至40目用于營養(yǎng)成分和微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定。

酶制劑：纖維素復(fù)合酶[纖維素酶(cellulase，≥10 000 U/g)+木聚糖酶(xylanase，≥120 000 U/g)+β-葡聚糖酶(β-glucanase，≥40 000 U/g)]、果膠酶(pectinase，≥10 000 U/g)、漆酶(laccase，10 000 U/g)，試驗(yàn)所用復(fù)合酶制劑及酶制劑均購自夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，粉末狀，常溫貯存。

活菌制劑：植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum，≥2×106CFU/g)、布什乳酸桿菌(Lactobacillusbuchneri，≥2×106CFU/g)，菌種保藏于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，活菌制劑凍干粉，置于4 ℃冰箱保存。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)組，分別為：秸稈原料組(CS組)、青貯對(duì)照組(CK組)、復(fù)合酶制劑組(CPL組)、復(fù)合酶-單活菌組(CPLP組)、復(fù)合酶-雙活菌組(CPLB組)。

處理方法如下：玉米秸稈刈割后，用青貯切碎揉搓機(jī)切短至1～2 cm，按表1的分組及添加劑量溶于蒸餾水，攪拌，將生物制劑均勻噴灑在粉碎的玉米秸稈上，水分調(diào)節(jié)至65%～70%。樣品均裝入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)，每袋1 kg，用真空包裝機(jī)(DZ-280/2SD)抽真空并封口，室溫(25～37 ℃)貯藏45 d后開封取樣。CK組直接添加蒸餾水，不添加任何生物制劑。另取玉米秸稈原料樣品置于冰盒中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃貯藏，待檢。每個(gè)組4個(gè)重復(fù)，3個(gè)用于樣品測(cè)定，1個(gè)為備用。

表1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3　測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.3.1發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)成分測(cè)定

取玉米秸稈青貯20 g，加入180 mL蒸餾水，勻漿1 min，用4層紗布過濾，用pH測(cè)定儀(Testo 205，德國)測(cè)定青貯浸出液的pH[6]。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮(NH3-N)含量[5]。使用GC128型氣相色譜儀分析乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)的含量，分析條件為：火焰離子化檢測(cè)器(FID)，柱2 m×4 mm，固定相Pora-pak Q(80目)，柱溫120 ℃，檢測(cè)器和進(jìn)樣器溫度230 ℃，氮?dú)?N2)流速65 mL/min，空氣流速300 mL/min，氫氣(H2)流速30 mL/min，靈敏度16×103，紙速5 mm/min?；瘜W(xué)分析法測(cè)定玉米秸稈生物發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分含量，包括干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、NDF、ADF、木質(zhì)素(lignin，L)[7]。

纖維素(cellulose，C)=ADF-
酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)；
半纖維素(hemicellulose，HC)=NDF-ADF；
總氮(total nitrogen，TN)含量=CP/6.25。

1.3.2玉米秸稈微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1.3.2.1一級(jí)結(jié)構(gòu)——聚合度

玉米秸稈樣品粉粹過40目，采用苯酚-硫酸法測(cè)定玉米秸稈樣品中的總糖含量，4，4′二羧酸-2，2′-喹啉(BCA)法測(cè)定玉米秸稈樣品中還原糖含量，總糖與還原糖的比值，即為玉米秸稈纖維素的聚合度[8]。

1.3.2.2二級(jí)結(jié)構(gòu)——傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(FTIR)圖譜

使用VERTEX 70V FTIR儀(Bruker 公司，德國)對(duì)不同組的玉米秸稈樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察，得出FTIR圖譜[5]。試驗(yàn)處理：玉米秸稈樣品粉碎2 min，過40目；65 ℃干燥12 h后，稱取1 mg樣品與50 mg溴化鉀(KBr)研磨均勻，使用FW-5壓片機(jī)，壓強(qiáng)1 Mpa，30～60 s，壓成直徑約13 mm的薄片。試驗(yàn)條件：掃描范圍在1 000～4 000 cm-1區(qū)間，光譜分辨率2 cm-1。

1.3.2.3三級(jí)結(jié)構(gòu)——X射線衍射(XRD)圖譜

使用D8-Advance型XRD儀(Bruker公司，德國)對(duì)不同組的玉米秸稈飼料進(jìn)行XRD掃描，得出XRD圖譜[5]。試驗(yàn)處理：各組樣品均粉碎2 min，過40目。試驗(yàn)條件：Cu-Ka，40 kV×40 mA，掃描速度1 ℃/min，步長0.04°，2θ掃描范圍3°～40°。觀察不同處理后的樣品結(jié)晶度變化，并根據(jù)Meyer等[9]提出的公式計(jì)算結(jié)晶度：

CrI(%)=[(I002-Iam)/I002]×100。

式中：CrI表示結(jié)晶度；I002表示纖維素Ⅰ在2θ為22°～23°時(shí)結(jié)晶強(qiáng)度的最大值(對(duì)于纖維素Ⅱ，2θ為18°～22°)；Iam表示纖維素Ⅰ在2θ為18°～19°時(shí)結(jié)晶強(qiáng)度的最小值(對(duì)于纖維素Ⅱ，2θ為13°～15°)。

1.3.2.4四級(jí)結(jié)構(gòu)——比表面積

采用伊紅美蘭法測(cè)定樣品的比表面積[10-11]。玉米秸稈樣品粉碎過40目，取0.2 g懸浮于25 mL美蘭溶液中，恒溫25 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，10 000 r/min離心15 min，取得上清液，在660 nm的波長下進(jìn)行比色，測(cè)得溶液中美蘭的含量，單位質(zhì)量玉米秸稈樣品吸附劑吸附美蘭的量可引據(jù)下列公式計(jì)算出：

q=[(C0-Ct)×V]/m。

式中：q表示單位質(zhì)量玉米秸稈樣品吸附美蘭的量(mg/g)；C0表示美蘭的初始濃度(mg/L)；Ct表示t時(shí)刻美蘭的濃度(mg/L)；V表示美蘭溶液的體積(L)；m表示玉米秸稈樣品的質(zhì)量(g)。

S=q×a。

式中：S表示比表面積(m2/g)；q表示單位質(zhì)量玉米秸稈樣品吸附美蘭的量(mg/g)；a為1 mg美蘭覆蓋固體的面積，對(duì)秸稈物質(zhì)為2.45 m2。

1.4　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2007初步整理后，采用SPSS 21.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVE)檢驗(yàn)程序進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　青貯玉米秸稈的營養(yǎng)成分

由表2可以看出，與CS組相比，玉米秸稈發(fā)酵45 d以后，其他各組的NDF、ADF、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量均顯著降低(P<0.05)。CS組的DM、CP、NDF、ADF、纖維素、半纖維素含量顯著高于CK組(P<0.05)。與CK組相比，CPL組的NDF、ADF、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量差異不顯著(P>0.05)，CPLP和CPLB組的NDF、ADF、纖維素、半纖維素含量均顯著降低(P<0.05)。

2.2　青貯玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)

由表3可以看出，各組玉米秸稈發(fā)酵后，pH均在4.2以下。與CK組相比，CPL組的NH3-N/TN和乳酸/乙酸均顯著降低(P<0.05)，乳酸含量差異不顯著(P>0.05)；CPLB組的乳酸含量顯著增加(P<0.05)，CPLP和CPLB組的NH3-N/TN和乳酸/乙酸均顯著降低(P<0.05)。各組均未檢測(cè)到丙酸和丁酸。

表2　酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈營養(yǎng)成分的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3　酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3　青貯玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)

2.3.1一級(jí)結(jié)構(gòu)——聚合度

由表4可以看出，玉米秸稈發(fā)酵后，纖維素的聚合度具有差異性。CS組的聚合度顯著高于CK組(P<0.05)。與CK組相比，CPL組的聚合度無顯著差異(P>0.05)；CPLP、CPLB組的聚合度分別顯著降低了38.92%、35.64%(P<0.05)。

表4　酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈聚合度的影響

2.3.2二級(jí)結(jié)構(gòu)——?dú)滏I作用力

1.玉米秸稈組(CS組)；2.青貯對(duì)照組(CK組)；3.復(fù)合酶制劑組(CPL組)；4.復(fù)合酶-單活菌組(CPLP組)；5.復(fù)合酶-雙活菌組(CPLB組)。下圖同。

1. corn stalk group (CS group)；2. corn silage group (CK group)；3. compound enzyme preparation group (CPL group)；4. compound enzyme preparation+single live bacteria group (CPLP group)；5. compound enzyme preparation+double live bacteria group (CPLB group). The same as below.

圖1酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈FTIR圖譜的影響

Fig.1Effects of enzyme-bacterial preparation on FTIR spectra of silage corn stover

2.3.3三級(jí)結(jié)構(gòu)——結(jié)晶度(XRD衍射)

由表5可以看出，經(jīng)過發(fā)酵以后，玉米秸稈的結(jié)晶度具有增加的趨勢(shì)。結(jié)晶度從大到小依次為CPL組>CPLB組>CPLP組>CK組>CS組。玉米秸稈的XRD圖譜如圖2所示。CPL、CPLP和CPLB組的101、002和004處晶面的衍射峰變寬，衍射強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明秸稈青貯后結(jié)晶度發(fā)生了改變。

表5　酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈結(jié)晶度的影響

圖2　酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈XRD圖譜的影響

2.3.4四級(jí)結(jié)構(gòu)——比表面積

纖維素的比表面積是表征纖維素微纖絲與纖維素降解酶分子間可接觸面積大小的參量，對(duì)微生物及纖維素降解酶的可及性均有較大的影響[10]。由表6可以看出，玉米秸稈發(fā)酵以后，與CK組相比，CPL組的比表面積無顯著差異(P>0.05)，CPLP和CPLB組的比表面積顯著增加(P<0.05)，但是變化范圍不大，其中CPLP組比表面積增加的最多。

表6　酶-菌制劑對(duì)青貯玉米秸稈比表面積的影響

3　討　論

3.1　青貯發(fā)酵作用對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)成分及微觀結(jié)構(gòu)的影響

3.2　復(fù)合酶制劑對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)成分及微觀結(jié)構(gòu)的影響

3.3　復(fù)合酶-菌制劑對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)成分及微觀結(jié)構(gòu)的影響

4　結(jié)　論

① 復(fù)合酶制劑+活菌制劑處理玉米秸稈，NDF、ADF、纖維素、半纖維素含量顯著降低，pH、NH3-N/TN、乳酸/乙酸比例顯著降低，改善了秸稈營養(yǎng)品質(zhì)。

② 玉米秸稈經(jīng)不同生物制劑處理，可有效破解秸稈的抗?fàn)I養(yǎng)結(jié)構(gòu)，降低纖維素中的非晶區(qū)域。復(fù)合酶制劑+活菌制劑處理可以使聚合度顯著降低，氫鍵作用力減弱，結(jié)晶度、比表面積顯著增加，秸稈細(xì)胞壁纖維素的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變。

③ 玉米秸稈4種纖維成分的降低與微觀結(jié)構(gòu)的聚合度降低、氫鍵作用力減弱、結(jié)晶度和比表面積增加相吻合，測(cè)定玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)可以從分子層面闡述秸稈破壁的程度。