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      常染色體STR基因座三等位基因在法醫(yī)DNA鑒定及臨床實踐中的意義

      2018-07-16 08:56:04周單華陳鵬宇余麗梅
      關(guān)鍵詞:嵌合體基因座法醫(yī)

      周單華,陳鵬宇,余麗梅

      (1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省細胞工程重點實驗室,貴州 遵義 563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院司法鑒定中心,貴州 遵義 563099; 3.遵義醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099)

      短串聯(lián)重復(fù)系列(short tandem repeat,STR)因其遺傳多態(tài)性高、檢測靈敏性強、種屬特異性強、可復(fù)合檢測和自動化分析等特點,已經(jīng)成為了國內(nèi)外法醫(yī)DNA鑒定應(yīng)用最為廣泛的遺傳標(biāo)記。常染色體STR分析具有符合二倍體遺傳標(biāo)記及孟德爾遺傳規(guī)律的特征,是進行法醫(yī)學(xué)個人識別和親子鑒定的常規(guī)分析方法。通常情況下,常染色體STR兩個等位基因相同時稱為純合子,在DNA分型圖譜上呈現(xiàn)出一個峰或一條帶;當(dāng)兩個等位基因不同時,稱為雜合子,其分型圖譜表現(xiàn)為兩個不同的峰或兩條帶。在極少數(shù)情況下會檢測到三個峰或者三條帶,這種情況稱之為三等位基因(tri-alleles)或三帶型。

      自STR三等位基因于1999年第一次被 Crouse等[1]人報道迄今,已經(jīng)在大量的STR上發(fā)現(xiàn)有三等位基因的存在。常染色體STR三等位基因?qū)Ψㄡt(yī)DNA分析中案件的檢測帶來一定影響,同時在某些疾病的輔助診斷分析中有特殊應(yīng)用價值。

      1 三等位基因形成機制和峰型表現(xiàn)模式

      常染色體STR三等位基因是個體STR分型時檢測到的一種異常分型現(xiàn)象,一般認為是發(fā)生于染色體異常所致基因數(shù)目異常改變的一種表現(xiàn)。其確切的形成機制尚不完全明確,國內(nèi)外主要存有以下幾4種觀點,而其峰型表現(xiàn)模式常見的有兩種。

      1.1同源染色體不分離(nondisjunction NDJ)二倍體生物在減數(shù)分裂期形成配子時,分布于同源染色體上的兩個等位基因分別隨機分配到兩個配子中并遺傳給子代[2]但當(dāng)染色體運動異時,常會導(dǎo)致其不分離[3]。同源染色體間著絲粒DNA含量差異,會引起姐妹染色單體連接程度和紡錘絲微管的數(shù)量的不同,進而導(dǎo)致MⅠ期中二價體向二極運動的拉力不均衡和MⅡ期中著絲粒分離時間的不一致。其可能的機制是:當(dāng)著絲粒中 DNA及其不對稱,會導(dǎo)致減數(shù)分裂時二價體向兩極運動的拉力將非常不均衡以及 MⅡ期中同源染色體之間著絲粒分開變得不同步,二極體同時移向某一極,這就直接導(dǎo)致了同源染色體在減數(shù)分裂時不分離,兩個等位基因進入同一個配子,與來自父方或母方的另一個配子結(jié)合,在此基因座上就形成了三等位基因,最終在DNA分型圖譜上表現(xiàn)出三個等位基因。

      1.2同源染色體不等價交換同源染色體非姐妹染色單體之間的不等價交換,使交換后的兩條姐妹染色單體中的其中一條上有一缺失片段,屬于染色體結(jié)構(gòu)缺失;另一姐妹染色單體上添加了相應(yīng)的片段,屬于染色體結(jié)構(gòu)的重復(fù)[4]。兩條同源染色單體之間進行不等價交換后,在一條染色單體上出現(xiàn)了2個等位基因,這條含有2個的等位基因的染色單體與另一正常個體來源的染色單體組成的子代的基因分型圖譜上會出現(xiàn)三個峰,即三等位基因。

      1.3嵌合體因為自發(fā)或者人為誘導(dǎo)因素導(dǎo)致人體的遺傳物質(zhì)不僅是來源于同一個細胞體系,而是源于兩個或兩個以上個體的細胞體系,形成由不同的基因型的細胞所構(gòu)成的生物體,生物學(xué)上稱之為嵌合體。可以分為兩類,一類為同源嵌合體(mosaic),另一類為異源嵌合體 (chimera)[5,6]。同源嵌合體者的細胞只來自于單個合子,自發(fā)或誘發(fā)導(dǎo)致的基因突變(腫瘤)以及染色體畸變(21-三體綜合癥)均可導(dǎo)致同源嵌合體的產(chǎn)生。同源嵌合體又分為一般性嵌合體(general mosaicism) 和限制性嵌合體(confined mosaicism)。異源嵌合體則是指某一個體的細胞來自二種或其他不同的合子系(Zygotelineage ) ,可分為三種類型:在STR分型上表現(xiàn)為三等位基因的人造異源嵌合體(artificial chimerism)和孿生子異源嵌合體(tiwn chimerism)以及表現(xiàn)為四等位基因的四配子異源嵌合體(tetragametic chimerism)[7,8]。如異基因個體來源的干細胞移植等外源性基因移植后,就可出現(xiàn)多等位基因,也可能是由于在異卵雙胞胎中發(fā)生子宮內(nèi)胚胎間血液交換等,在STR分型圖譜上均可出現(xiàn)為三等位基因形式。

      1.4非特異性擴增當(dāng)某個基因座有額外的引物結(jié)合位點時,在PCR擴增時,除了擴增正常的二等位基因位點,額外的引物結(jié)合位點也同時擴增,導(dǎo)致STR圖譜出現(xiàn)三等位基因。曾有文獻報道家族六位成員TPOX基因座上出現(xiàn)額外等位基因10,產(chǎn)生三等位基因的原因與其X染色長體臂某段基因座有潛在的關(guān)聯(lián)[9]。

      1.5三等位基因的峰型模式三等位基因由于其形成機制不同,其峰型模式常見有以下兩種不同表現(xiàn)。一類為三個等位基因中其中兩個峰的峰高總和與第三個峰高接近(見圖1),另一類為三個等位基因峰高較為一致[10-11](見圖2)。研究發(fā)現(xiàn),前一峰型大概由于在減數(shù)分裂期分布于染色體上的某雜合子基因座上發(fā)生了重排,而后一峰型是由于某些體細胞雜合子基因座產(chǎn)生了突變,其發(fā)生率相對更高些[10]。

      圖1 兩個峰的峰高總和與第三個峰高接近

      圖2 三個峰的峰高一致

      2 三等位基因?qū)Ψㄡt(yī)鑒定DNA分型結(jié)果的影響

      法醫(yī)DNA分型中,個體常染色體STR三等位基因的檢出增加了案件分析的不確定和復(fù)雜性,為法醫(yī)工作者帶來了新的挑戰(zhàn)。如單一樣本來源的不確定性、檢測方法的可靠性、法醫(yī)學(xué)參數(shù)計算原理與常規(guī)案件處理的不一致性等。同時對不同STR基因座三等位基因發(fā)生規(guī)律的認識,也可為法醫(yī)DNA實踐提供一定的指導(dǎo)。

      2.1存在三等位基因的STR基因座從首次報道STR三等位基因到目前為止,在 STR Base 數(shù)據(jù)庫(http://strbase.nist.gov/tri_tab.htm)收錄了檢測到 13個CODIS基因座和14個非 CODIS基因座上產(chǎn)生三等位基因的情況[12](見表1~2)。

      表1CODIS基因座三等位基因模式統(tǒng)計

      基因座例數(shù)染色體位置Gene bank系列號基序漢族人群中PIC值[13]FGA404q28M64982CTTT0.8479CSF1PO95q33.1X14720TAGA0.6894TH01511p15.5D00269TCAT0.6108TPOX192p25.3M68651GAAT0.5577VWA2612p13.31M25858[TCTG][TCTA]0.7696D3S1358113p21.31AC099539[TCTG][TCTA]0.6691D5S81885q23.2G08446,AC008512AGAT0.7748D7S820227q21.11G08616, AC004848GATA0.7369D8S1179228q24.13G08710[TCTA][TCTG]0.8271D13S3171613q31.1G09017,AL353628.2TATC0.7718D16S5391316q24.1G07925,AC024591.3GATA0.7502D18S514418q21.33X91254,AP001534AGAA0.8459D21S112721q21.1M84567Complex[TCTA][TCTG]0.7948合計262

      由表1中CODIS基因座的結(jié)果可見,重復(fù)序列較長、基序結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、具有更高的遺傳多態(tài)性的基因座可以檢測到更多的三等位基因。如三等位基因次數(shù)最多的基因座依次是D18S51(44次)、FGA(40次)和D21S11(27次)[14]。而遺傳多態(tài)性較差的基因座則不太容易觀察到三等位基因的出現(xiàn),如D5S818(8次)和TH01(5次)基因座的STR重復(fù)系列AGAT和TCAT就比較簡單、多態(tài)性程度也低[15-17]。

      表2非CODIS-STR基因座三等位基因模式統(tǒng)計

      基因座例數(shù)染色體位置Gene bank系列號基序漢族人群中的PIC值[13]D2S1338102q35AC010136 ; G08202[TGCC]n[TTCC]n0.8473D19S4331219q12G08036 ; AC008507.6[AAGG][AAAG][AAGG][TAGG][AAGG]n0.7917Penta D1221q22.3AP001752[AAAGA]0.7862Penta E1615q26.2AC027004[AAAGA]0.9114F13A0116P24-P25M21986AAAG-FES/FPS115q25X06292AAAT-F13B11q31-q32M64554AAAT-LPL18p22D83550AAAT-SE3366q14V00481AAAG0.9402D10S1248210q26.3AL391869GGAA0.7095D12S391212p13.2 G08921[AGAT]8-17[AGAC]6-10[AGAT]0-10.8237D22S1045122q12.3 AL022314ATT0.7324D1S165631q42G07820[TAGA]n[TGA]0-1[TAGA]n[TAGG]0-1[TG]50.8093D2S44112p14AC079112TCTA0.7426合計69

      “-”表示暫無相關(guān)數(shù)據(jù)。

      表2中非CODIS基因座觀察到三等位基因次數(shù)最多的基因座依次為:Penta E(16次)、Penta D(12次)、D19S433(12次)和D1S1338( 10次)。同CODIS基因座表現(xiàn)出三等位基因的規(guī)律一致,這幾個基因座在人群中的遺傳多態(tài)性較高。觀察到三等位基因比較少的基因座則是F13A01、FES/FPS、F13B、LPL、D2S441、D22S1045,都僅有一次報道。例如D2S1045是ATT的重復(fù)系列,還有一個原因是這些基因座與CODIS基因座比較起來,開發(fā)利用相對較晚,所以目前發(fā)現(xiàn)的三等位基因的例數(shù)不多。

      2.2三等位基因的判定三等位基因現(xiàn)象在法醫(yī) DNA 日常案件檢測中比較少見。但如若在實際工作中檢測到某個基因座呈三等位基因,需要對該基因是否為真實的三等位基因進行確認。首先應(yīng)通過重復(fù)實驗排除模板污染以及操作過程中人員自身 DNA 污染問題;其次還必須針對同一個基因座使用引物序列不同的其他擴增體系進一步驗證,不同試劑盒撿測結(jié)果一致,才可認定為三等位基因,得到可靠和準(zhǔn)確的檢測結(jié)果[18]。

      2.3三等位基因的親權(quán)指數(shù)計算方式三等位基因的出現(xiàn)涉及到父權(quán)指數(shù)計算,也涉及到鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和規(guī)范性,目前的計算方式主要有以下幾種。第1種方法:在親子鑒定和個體識別實踐檢案中,如果子代的三等位基因確定是父親或母親遺傳時,可將其中的兩個當(dāng)作為一個稀有等位基因去計算親權(quán)指數(shù)值[19],如果采用遺傳頻率進行計算,可以用兩個等位基因頻率的乘積估計在群體中遺傳的頻率。對于不能確定子代中等位基因親本來源的,可將其中任意兩個等位基因頻率相乘后取最小值用以計算[20]。第2種方法:即按照 Brenner 等采用的方法,根據(jù)母親是否參與親權(quán)鑒定,采用對應(yīng)的公式進行計算,若子代三等位基因是遺傳過程中產(chǎn)生的突變,則參照平常親子鑒定案件中突變等位基因處理的方法,將等位基因頻率與平均突變系數(shù)相乘后進行親權(quán)指數(shù)的計算。第3種方法:參照劉芳等人的計算方式,根據(jù)三聯(lián)體親子鑒定案例中常染色體STR 三等位基因情況的不同,將父權(quán)指數(shù)的計算公式歸納為5類[21],其中第一類孩子三等位基因中用成對遺傳的等位基因 R 和 S不分離(Nondisjunction,NRS)表示,又分為四種亞類。以上3種方法以劉芳等人的計算方式更為具體化,日常工作中可根據(jù)案件實際情況選擇合適的計算公式。

      3 三等位基因的臨床應(yīng)用價值

      3.1遺傳性疾病輔助診斷臨床比較常見的三體綜合癥包括以下3種:13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征。目前,有文獻報道,用分別位于21號染色體的基因座 PentaD 和 D21S11、18 號染色體上的基因座 D18S51等分別快速輔助診斷或篩查21-三體綜合癥和18-三體綜合征[22-27]。

      此外,同 STR 基因分型用于親子鑒定的原理一樣,可將妊娠期胎兒的絨毛組織和其的母體組織的SRT多態(tài)性進行對比分析,用以鑒別葡萄胎中雙親的遺傳成分,STR 基因分型可以明確區(qū)分一個雙雌非葡萄胎妊娠三倍體和真正的雙雄PHM 三倍體,也有助于確定如三體或單體病等孤立的染色體異,常以達到鑒別診斷的目的[28];STR 圖譜基因分型分析在部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole,PHM)與完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole,CHM) 的鑒別診斷中具有重要作用[29]。

      3.2異基因干細胞移植后移植物存活狀態(tài)的判斷利用STR基因座分型技術(shù)對異基因干細胞移植的造血干細胞、間充質(zhì)干細胞在受者的植入、存活情況進行動態(tài)監(jiān)測,已成為異基因細胞移植術(shù)后常用的植入證據(jù)檢測手段。因此,除了用于法醫(yī)親子鑒定和個體識別的三等位基因檢測,在血液病救治等臨床療效和不良反應(yīng)監(jiān)測中具有更為廣闊的應(yīng)用前景,不僅可早期靈敏的判斷移植后造血干細胞的植活狀態(tài),而且為研究和探討嵌合體形成、移植排斥以及移植后復(fù)發(fā)提供了一種很好的評價方法[30-34]。病人在進行了異基因造血干細胞移植后,當(dāng)移植物存活或形成嵌合體時,在受者體內(nèi)可檢查到來自供者細胞的與受者基因分型不同的等位基因,在圖譜上可表現(xiàn)為三等位基因峰型;移植物成活后,慢性移植物抗宿主病與完全嵌合體的發(fā)生率有高度的一致性。由此推測,隨著異基因干細胞治療轉(zhuǎn)化應(yīng)用的逐漸增多,利用STR分型技術(shù)進行三等位基因檢測可能成為干細胞制劑體內(nèi)分布和代謝動力學(xué)研究的較好方法之一。

      3.3判斷臍血中的母血污染隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步和發(fā)展,采取在孕早期絨毛穿刺或孕中期羊水穿刺,使得更多的單基因遺傳病能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)前篩查和確診。目前,單基因遺傳病診斷和胎兒染色體檢查仍采用介入性產(chǎn)前診斷。雖然不同單基因病診斷采取的相關(guān)實驗室技術(shù)相差較大,但絕大部分依然是通過采取的胎兒組織,進行基因擴增后對產(chǎn)物進行STR分型及分析。因為基因擴增具有高度靈敏的特性,即使混入極微量母體組織也會影響到基因診斷的準(zhǔn)確性,導(dǎo)致結(jié)果的誤判。若臍血中存在母血污染,則在某些基因座上會檢測到三等位基因(胎兒和母體基因座基因分型為非純合子時)。因此,根據(jù)抽取的胎兒臍帶血細胞是否檢測到STR 三等位基因,可以作為判斷母血是否污染臍血有效的檢測方法[35],此種檢測方法具有其他方法不可比擬的靈敏度高、特異性強和操作簡捷的優(yōu)勢。

      4 展望

      隨著DNA檢測技術(shù)的不斷進步,將有越來越多的三等位基因被發(fā)現(xiàn)報道。伴隨著三等位基因研究的不斷深入,既有助于進一步加深法醫(yī)物證案件中異常DNA分型的理解和應(yīng)用,同時三等位基因的特殊分型也可以良好地應(yīng)用于臨床特定疾病的篩查、診斷以及療效和預(yù)后的評估。

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