太空茄子葉黃酮大孔樹(shù)脂純化工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

楊 彬 金小青 李彩霞 焦 揚(yáng)

(1. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000;2. 甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000)

茄子(FructussolanμmmelongenaL.)為茄科茄屬以漿果為產(chǎn)品的一年生草本植物。原產(chǎn)地印度，在中國(guó)已有1 500 多年的栽培歷史[1]。太空茄作為其品種之一，產(chǎn)量高、品質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)豐富。茄葉作為茄子生產(chǎn)中的下腳料，資源豐富，目前主要被作為飼料或肥料使用，附加值較低。對(duì)茄子葉黃酮分離純化的研究相對(duì)較少，僅見(jiàn)莫天錄等[2]采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)綠茄葉中黃酮的純化研究，未見(jiàn)有關(guān)太空茄葉的研究報(bào)道。

黃酮類(lèi)化合物是指以色原酮為母核的一大類(lèi)有機(jī)化合物，是植物重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的各個(gè)器官[3]。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗炎[4]、保肝、防止心血管疾病、抗過(guò)敏、抗突變[5]、皮膚抗衰老美容等多種生理功能[6]，因而黃酮被稱(chēng)為“第七類(lèi)營(yíng)養(yǎng)素”。目前眾多學(xué)者從天然植物中提取黃酮等活性成分，然而茄子各部位含有許多活性成分[7]，其果實(shí)是重要的蔬菜。茄子果實(shí)采摘后，用茄子葉提取黃酮并進(jìn)行分離純化，補(bǔ)充活性成分資源不足，變廢為寶。

大孔樹(shù)脂是近年發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)具有多孔立體結(jié)構(gòu)的有機(jī)高分子聚合物吸附劑，具有吸附容量大、選擇性好、容易解吸、機(jī)械強(qiáng)度大、可重復(fù)使用等特點(diǎn)[8]，已廣泛應(yīng)用于多酚、生物堿、二氫槲皮素、皂苷等活性成分的分離純化[9-10]。本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)5種不同類(lèi)型大孔樹(shù)脂的吸附和解吸性能進(jìn)行比較，篩選適宜的純化太空茄葉黃酮的大孔樹(shù)脂，對(duì)其靜態(tài)吸附、解吸及動(dòng)態(tài)純化效果進(jìn)行分析，并測(cè)定純化前后黃酮提取物含量及抗氧化活性，以期為太空茄子葉黃酮深度開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

太空茄子葉片： 河西學(xué)院農(nóng)學(xué)試驗(yàn)園采摘；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；

無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁，氫氧化鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

D101、D4020、X-5、AB-8、NAK-Ⅱ樹(shù)脂：物理屬性見(jiàn)表1，天津南開(kāi)大學(xué)化工廠；

雙配套循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-2000型，河南省鞏義市英峪予華儀器廠；

分光光度計(jì)：Spectrμmlab24型，上海棱光技術(shù)有限公司；

表1 吸附樹(shù)脂的物理性質(zhì)Table 1 Physical properties of the adsorption resin

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國(guó)華電器有限公司；

電子天平：FA2104型， 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

層析柱：Φ15 mm×30 mm，上海亞榮生化儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RG-2000A型，鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HZP-250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

自動(dòng)核酸蛋白分離層析儀：MC99-2型，上海青浦滬西儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：Scientz-100F型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 黃酮的提取與測(cè)定

1.2.1 太空茄葉預(yù)處理 太空茄子葉片清洗、陰干、粉碎、過(guò)250 μm篩，按照1∶5 (g/mL)比例加入石油醚回流2.5 h，除去葉片中的色素、揮發(fā)油等物質(zhì)后風(fēng)干備用。

1.2.2 太空茄葉黃酮粗提取的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理的50 g 太空茄子葉粉末，按照1∶42 (g/mL)比例加入78%的乙醇，80 ℃回流提取1.8 h，冷卻后真空抽濾，收集上清液，減壓濃縮回收乙醇，冷凍干燥后得太空茄葉黃酮浸膏；稱(chēng)取2.5 g 黃酮浸膏，用去離子水溶解，移至250 mL容量瓶并定容，得到質(zhì)量濃度1.79 mg/mL的黃酮溶液，冷藏備用。

1.2.3 太空茄子葉黃酮含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]，根據(jù)式(1)計(jì)算黃酮含量。

(1)

式中：

Y——黃酮含量，%；

C——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得黃酮質(zhì)量，μg；

V——黃酮提取液總體積，mL；

N——樣品的稀釋倍數(shù)；

M——樣品的重量，g；

VS——測(cè)定時(shí)所取溶液的體積，mL。

1.3 最佳樹(shù)脂篩選

1.3.1 樹(shù)脂預(yù)處理 試驗(yàn)選用的5種樹(shù)脂分別用無(wú)水乙醇浸泡24 h后過(guò)濾，采用去離子水沖洗至無(wú)乙醇味；吸干樹(shù)脂表面水分后用5% HCl浸泡3 h；去離子水沖洗至中性，用2% NaOH浸泡3 h，去離子水洗至中性，吸干樹(shù)脂水分后備用[12-13]。

1.3.2 樹(shù)脂吸附率和解吸率測(cè)定 取5種預(yù)處理后大孔樹(shù)脂各2.0 g，置于100 mL三角瓶中，分別加入一定濃度的黃酮溶液15 mL，在25 ℃、150 r/min恒溫振蕩24 h 后過(guò)濾，測(cè)定濾液中黃酮含量；在吸附飽和的樹(shù)脂中加入15 mL 體積分?jǐn)?shù)為78%的乙醇溶液，振蕩解吸24 h后過(guò)濾，測(cè)濾液中黃酮含量，按式(2)～(4)計(jì)算吸附率、解吸率及吸附量[14]。

(2)

(3)

(4)

式中：

α——吸附率，%；

β——解吸率，%；

T——吸附量，mg/g；

C0——初始樣液黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V0——初始樣液體積，mL；

C1——吸附平衡后黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

C2——解吸液中黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

M——預(yù)處理后樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.3.3 靜態(tài)吸附 取2.0 g預(yù)處理樹(shù)脂NAK-Ⅱ，放置在50 mL 三角瓶中，以吸附時(shí)間、黃酮質(zhì)量濃度、樣液pH為單變量，加15 mL黃酮提取液，在25 ℃、150 r/min的條件下振蕩吸附飽和后，按前述方法測(cè)黃酮含量，計(jì)算吸附率。分別以吸附率對(duì)時(shí)間、濃度、pH作圖并繪制靜態(tài)吸附曲線(xiàn)。

1.3.4 靜態(tài)解吸 取2.0 g預(yù)處理樹(shù)脂NAK-Ⅱ，以解吸時(shí)間、解吸劑體積分?jǐn)?shù)、解吸劑pH值為單變量，加15 mL乙醇解吸液，25 ℃、150 r/min條件下振蕩解吸，按前述方法測(cè)定解吸液黃酮含量，計(jì)算解吸率。分別以解吸時(shí)間、解吸劑體積分?jǐn)?shù)、解吸劑pH值作圖并繪制靜態(tài)解吸曲線(xiàn)。

1.3.5 太空茄子葉黃酮的NKA-II樹(shù)脂柱層析 預(yù)處理的NKA-II樹(shù)脂，濕法裝柱(層析柱15 mm×140 mm)，用5倍柱床體積(BV)的蒸餾水除雜后，取質(zhì)量濃度為362.6 μg/mL的粗黃酮，以1.7 BV/h的流速對(duì)黃酮上柱純化。再用12 BV的蒸餾水除雜后以8 BV、70%的乙醇解吸，每3 min收集2.1 mL，每管取0.3 mL測(cè)定黃酮含量。

1.3.6 NKA-II樹(shù)脂對(duì)太空茄子葉黃酮的純化效果 分別稱(chēng)取0.1 g粗黃酮和經(jīng)純化后的黃酮，用78%的乙醇溶解后定容至50 mL，各取0.4 mL測(cè)定黃酮含量，并計(jì)算純化黃酮倍數(shù)。

1.3.7 純化前后太空茄子葉黃酮抗氧化活性

(1) 對(duì)DPPH·清除力：根據(jù)文[15～16]修改如下，吸取質(zhì)量濃度為33.6，16.8，13.4，6.7，4.5，3.4，2.7 μg/mL的純化前后黃酮液2.00 mL，分別加入0.15 mmol/L DPPH溶液2 mL，混合均勻后常溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)i，并以2.00 mL黃酮液和2.00 mL 95%乙醇為樣品空白組，以相同質(zhì)量濃度的蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照。按式(5)計(jì)算清除率。

(5)

式中：

CR——清除率，%；

A0——未加黃酮液樣品的吸光度；

Aj——相應(yīng)質(zhì)量濃度黃酮液的本底吸光度；

Ai——樣品組吸光值。

(2) 對(duì)ABTS+·清除力：根據(jù)文獻(xiàn)[17]。按式(5)計(jì)算ABTS+·清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，不同樹(shù)脂之間的顯著性差異采用新Duncan復(fù)極法進(jìn)行比較。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果分析

2.1 最佳樹(shù)脂類(lèi)型的篩選

如表2所示，D101與D4020差異不顯著，但NAK-Ⅱ與其他樹(shù)脂差異顯著；從解吸率看，NAK-Ⅱ與D4020差異不顯著，NAK-Ⅱ與其他樹(shù)脂差異顯著。X-5的解吸率較高，但其吸附率最低；NAK-Ⅱ吸附率和解吸率均最高。綜合吸附率、解吸率和吸附容量3個(gè)參數(shù)，得出NAK-Ⅱ類(lèi)型樹(shù)脂是較好的吸附樹(shù)脂，以下試驗(yàn)用NAK-Ⅱ大孔樹(shù)脂對(duì)太空茄子葉黃酮進(jìn)行純化。

2.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

2.2.1 吸附時(shí)間對(duì)NAK-Ⅱ樹(shù)脂吸附率的影響 從圖1中

表2 5種樹(shù)脂對(duì)太空茄子葉黃酮吸附率與解吸率的影響?

Table 2 Effects of 5 macroporous resins on absorption and desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

樹(shù)脂型號(hào)總黃酮吸附容量/(mg·g-1)總黃酮吸附率/%總黃酮解吸率/%D10111.2083.44b68.23dcD402011.2483.75b71.00abX-59.7972.92d70.88abAB-810.6079.00c64.24dNKA-II12.9796.64a71.29a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 吸附時(shí)間對(duì)太空茄葉黃酮吸附率的影響Figure 1 Effects of absorption time on adsorption rates of flavonoids from eggplant leaves

可看出，吸附時(shí)間在0.5～1.0 h時(shí)吸附率增長(zhǎng)迅速，1.0 ～2.5 h 時(shí)吸附速率較快，2.5 h后達(dá)到平衡，之后隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，吸附率變化趨于平緩。因此，確定吸附時(shí)間為2.5 h。

2.2.2 樣品質(zhì)量濃度對(duì)NAK-Ⅱ樹(shù)脂吸附的影響 由圖2可知，太空茄子葉黃酮的吸附率隨其質(zhì)量濃度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為0.362 6 mg/mL時(shí)吸附率達(dá)最大值(98.257 4%)；繼續(xù)增大黃酮質(zhì)量濃度，吸附率開(kāi)始降低?？赡苁屈S酮濃度越高，其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、羰基官能團(tuán)容易構(gòu)成氫鍵而聚合成大分子，不易被吸附。因此，黃酮粗提液最佳質(zhì)量濃度為0.362 6 mg/mL。

2.2.3 黃酮粗提取液pH對(duì)NAK-Ⅱ樹(shù)脂吸附的影響 從圖3可以看出，太空茄子葉黃酮的吸附率隨其粗提液pH值的升高呈下降趨勢(shì)，當(dāng)pH值為2時(shí)黃酮的吸附率最高(97.49%)。原因可能是pH值較小時(shí)，弱酸性黃酮類(lèi)物質(zhì)呈現(xiàn)為分子形式，通過(guò)范德華力相互作用被吸附；當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，黃酮類(lèi)分子中酚羥基H+容易失去，形成離子結(jié)構(gòu)，不易被樹(shù)脂吸附。因此，適宜的黃酮粗提液pH值為2。

圖2 樣品濃度對(duì)太空茄葉黃酮吸附率的影響

Figure 2 Effects of sample concentrations on absorption rates of flavonoids from eggplant leaves

圖3 樣液pH對(duì)太空茄葉黃酮吸附率的影響Figure 3 Effects of sample pH on absorption rates of flavonoids from eggplant leaves

2.3 靜態(tài)解吸試驗(yàn)

2.3.1 太空茄子葉黃酮在NAK-Ⅱ樹(shù)脂上的解吸曲線(xiàn) 由圖4可以看出，解吸時(shí)間在前10 min內(nèi)，解吸率隨時(shí)間的延長(zhǎng)增長(zhǎng)較快；10 min后，吸附率增長(zhǎng)較緩慢；當(dāng)解吸時(shí)間到40 min時(shí)，解吸基本趨于平衡。因此，確定解吸時(shí)間為40 min。

圖4 解吸時(shí)間對(duì)太空茄子葉黃酮解吸率的影響Figure 4 Effects of time on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

2.3.2 乙醇濃度對(duì)NAK-Ⅱ樹(shù)脂解吸效果的影響 黃酮類(lèi)化合物大部分為極性且其范圍較廣泛。依據(jù)“相似相容”原理，不同極性的黃酮類(lèi)化合物能溶于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇。從圖5可以看出，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，解吸率先上升后下降；乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值(72.79%)。因此，宜選用70% 的乙醇作洗脫劑。

2.3.3 解吸pH對(duì)NAK-Ⅱ樹(shù)脂解吸效果的影響 從圖6可以看出，隨著乙醇pH值增大，黃酮解吸率呈下降趨勢(shì)。乙醇為極性溶劑，可使大孔樹(shù)脂溶脹，降低了樹(shù)脂的吸附力，但酸的電離作用可提高乙醇溶液的極性，從而增強(qiáng)大孔樹(shù)脂的解吸率。試驗(yàn)宜選用pH 為3的乙醇為洗脫液。

2.4 太空茄子葉黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)

太空茄子葉黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖7。當(dāng)用去42 mL(第20管)洗脫液時(shí)，達(dá)到洗脫最高峰；當(dāng)洗脫液用去8 BV(即200 mL時(shí))，洗脫液幾乎呈無(wú)色，說(shuō)明太空茄子葉黃酮已基本解吸完全。表明采用體積分?jǐn)?shù) 70%、pH值為3.0的乙醇溶液可以較好地解吸NKA-II樹(shù)脂吸附的太空茄子葉黃酮，同時(shí)也表明NKA-II樹(shù)脂對(duì)太空茄子葉黃酮的靜態(tài)試驗(yàn)結(jié)果是可行的。

圖5 乙醇濃度對(duì)太空茄葉黃酮解吸率的影響

Figure 5 Effects of ethanol concentrations on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

圖6 解吸pH對(duì)太空茄子葉黃酮解吸率的影響Figure 6 Effects of pH on desorption rates of flavonoids from eggplant leaves

圖7 太空茄子葉黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫曲線(xiàn)Figure 7 Dynamic elution curve of flavonoids from eggplant leaves

2.5 NKA-II樹(shù)脂對(duì)太空茄子葉黃酮的純化效果

純化后的太空茄子葉黃酮液經(jīng)濃縮干燥后為黃色粉末，測(cè)定其干物質(zhì)中黃酮含量為64.59%，而粗品中黃酮含量為17.91%，由此可見(jiàn)，純化后干物質(zhì)中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高，是粗提物的3.61倍。

2.6 對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，可捕獲(清除)其它自由基，其醇溶液呈現(xiàn)深紫色，中和后會(huì)變無(wú)色或淺黃色，在517 nm處有一強(qiáng)吸收峰。DPPH·存在單電子，加入樣品后，抗氧化物質(zhì)釋放的電子與DPPH·配對(duì)，使其吸收能力下降，顏色由深變淺。顏色的變化與其接受電子數(shù)呈定量關(guān)系，因此可以通過(guò)褪色程度來(lái)衡量清除活性的大小。太空茄子葉黃酮對(duì)DPPH·清除力見(jiàn)圖8和表3。

圖8 太空茄子葉黃酮對(duì)DPPH·的清除率Figure 8 Scavenging effects of flavonoids from eggplant leaves on DPPH·表3 清除DPPH·的IC50值?Table 3 The IC50 values for scavenging DPPH·

樣品對(duì)數(shù)回歸方程R2IC50值/(μg·mL-1)蘆丁 y=28.537ln(x)-18.3460.911 310.97純化前黃酮y=28.648ln(x)-33.2850.940 118.31純化后黃酮y=27.782ln(x)-33.7680.966 120.39

?y為DPPH·清除率，%；ln(x)為純化前后對(duì)應(yīng)黃酮或蘆丁質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)。

由圖8可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著各樣品質(zhì)量濃度的增大，DPPH·清除率均呈遞增趨勢(shì)。由表3可知，IC50值可確定清除DPPH·能力大小依次為蘆丁>純化前>純化后，說(shuō)明純化前太空茄子葉黃酮所含的清除DPPH·的成分較純化后多。

2.7 對(duì)ABTS+·的清除能力

ABTS+·是一種ABTS經(jīng)氧化生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色水溶性自由基。ABTS+·清除法目前已廣泛用于生物總抗氧化力測(cè)定中。當(dāng)加入樣品后，若含有抗氧化物質(zhì)提供供氫體，使其溶液顏色變淺，導(dǎo)致在734 nm處的特征吸光度降低。溶液褪色變化與抗氧化劑濃度呈正比，因此依據(jù)溶液褪色變化，可以判斷提取物或檢測(cè)物的抗氧化能力，太空茄子對(duì)ABTS+·的清除能力見(jiàn)圖9和表4。

從圖9可以看出，本試驗(yàn)范圍內(nèi)，ABTS+自由基的清除率是隨樣品質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢(shì)，在太空茄子葉黃酮含量為13.4 μg/mL時(shí)，ABTS+·清除率趨于平緩，達(dá)到97%左右。由表4可知，IC50值可確定ABTS+·清除能力大小依次為蘆丁>純化后>純化前。

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)太空茄子葉黃酮純化參數(shù)及抗氧化活性進(jìn)行了研究，得出NKA-II是分離純化黃酮的理想吸附劑，吸附平衡時(shí)間為2.5 h；解吸平衡時(shí)間為40 min；在吸附液pH為2.0、濃度為362.6 μg/mL時(shí)吸附能力最強(qiáng)；pH值為3.0、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗脫效果最好，黃酮解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)，此變化趨勢(shì)與前人[18]研究結(jié)果一致。NKA-II純化后黃酮對(duì)ABTS+·清除能力大于純化前，純化后黃酮對(duì)DPPH·清除能力則小于純化前，純化前后黃酮對(duì)ABTS+·、DPPH·清除能力均小于蘆丁。使用該方法，效率高、成本低、操作簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)太空茄子葉黃酮工業(yè)化生產(chǎn)。后續(xù)將對(duì)黃酮的組分與結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，建立NKA-II大孔樹(shù)脂吸附黃酮的動(dòng)態(tài)吸附傳質(zhì)方程，為固定床吸附設(shè)備的設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。

圖9 太空茄子葉黃酮對(duì)ABTS+·的清除率Figure 9 Scavenging effects of flavonoids from eggplant leaves on ABTS+·表4 清除ABTS+·的IC50值?Table 4 The IC50 values for scavenging ABTS+·

樣品對(duì)數(shù)回歸方程R2IC50值/(μg·mL-1)蘆丁 y=13.636ln(x)+56.3670.828 40.63純化前黃酮y=19.345ln(x)+37.8010.874 11.88純化后黃酮y=19.069ln(x) + 39.770.885 61.71

?y為ABTS+·清除率，%；ln(x)為純化前后對(duì)應(yīng)黃酮或蘆丁質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)。