寒溫帶興安落葉松林土壤細菌微生物量和群落組成研究

楊立賓，隋　心，朱道光，崔福星，李金博，宋瑞清，倪紅偉

（1.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江大學 生命學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

土壤微生物既是森林生態(tài)系統(tǒng)中的分解者，同時也是消費者，在森林生態(tài)系統(tǒng)中參與物質的循環(huán)、能量的流動和信息的傳遞。土壤微生物的種類組成和群落結構很大程度上決定著土壤的生物活性[1-2]，因此通過土壤微生物的結構特征變化能夠預測森林生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能[3-4]。目前，有關土壤微生物的研究越來越多，而土壤微生物中土壤細菌的種類和數量最多[5]，與此相關的研究也受到廣泛關注。由于土壤細菌數量大、種類多，用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法進行分離鑒定遠遠不能反映土壤微生物的真實情況[6-8]。磷脂脂肪酸分析法通過對生物活體細胞膜重要組分進行鑒定，從而獲得土壤微生物量以及多樣性等方面信息[9]。高通量測序技術是第二代測序技術，具有通量高、靈敏度好、可重復性強等優(yōu)點，能夠系統(tǒng)、全面地測定和分析土壤微生物的群落結構特征及其功能。目前這些技術已廣泛地應用于環(huán)境、醫(yī)療等與微生物相關的研究領域中[10]。

大興安嶺林區(qū)地處北半球高緯度區(qū)域，是響應全球氣候變化最敏感的地區(qū)之一[11-12]。興安落葉松Larix gmelini作為主要的建群種和優(yōu)勢種，是大興安嶺地區(qū)的地帶性植被，也是寒溫帶氣候條件下形成的氣候演替頂級群落；其垂直分布能夠達到森林分布的最上限，且林分面積大，蓄積量高，是我國主要的木材生產基地[13]，也是我國北方森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對改善東北乃至全國的森林生態(tài)環(huán)境、促進林業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用[14]。

目前大興安嶺地區(qū)有關土壤微生物的報道多是基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行的研究，這遺漏了土壤中的絕大多數微生物，難以反映微生物結構和功能的全貌。因此，本研究在黑龍江呼中國家級自然保護區(qū)內2014年建成的興安落葉松林永久性固定監(jiān)測樣地中，以自然形成的蘚類興安落葉松林、杜香興安落葉松林、草類興安落葉松林和杜鵑興安落葉松林為研究對象，采用磷酸脂肪酸法和高通量測序分析方法對土壤細菌的微生物量和組成結構進行分析研究，探討不同林型土壤細菌群落結構變化特征和影響因子，揭示其變化規(guī)律，為興安落葉松林的保護研究和大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)保護等提供理論參考。

1　材料與方法

1.1　研究區(qū)概況與樣品采集

研究區(qū)域位于大興安嶺呼中國家級自然保護區(qū)內，樣地位于2014年建成的大興安嶺興安落葉松林25 hm2永久性固定監(jiān)測樣地內。樣地地形平緩，海拔為847～974 m，年均氣溫-4 ℃，年均降水量497.7 mm，年平均相對濕度為71%。群落結構比較簡單，以興安落葉松為主要優(yōu)勢種的寒溫帶針葉林，形成蘚類-興安落葉松林、杜香-興安落葉松林、草類-興安落葉松林和杜鵑-興安落葉松林4種主要群落類型；分別對應冰凍沼澤土、表淺棕色針葉林土、生草棕色針葉林土和典型棕色針葉林土4種土壤類型。樣地內共有Dbh＞1 cm的木本植物41種，其中喬木4種，灌木14種，草本127種，隸屬于21科39屬。

2016年7月對樣地的4個不同類型土壤進行樣地調查采樣工作。4個林型對應的土壤類型下文中分別以A、B、C、D代替。在大樣地中每個類型土壤選取3個樣方（20 m×20 m），去除腐殖質層，用直徑為10 cm的土鉆在每個樣方地的四角和中心位置分別采集土層0～10 cm處的土壤樣品，充分混合后作為土壤的混合樣品。人工挑出凋落物、細根和小石塊等雜物后過2 mm尼龍篩并分成2份，一份放置冷藏箱內4 ℃保存，帶回實驗室，保存于-80 ℃，用于土壤微生物測定；另一份土壤帶回實驗室用于測定土壤理化參數。

1.2　試驗方法

土壤理化性質的測定在黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所進行。土壤含水率采用鋁盒烘干法測定，土壤含水率采用烘干法測定；pH值采用電位法測定；土壤總氮、堿解氮、有機碳質量分數采用CN元素分析儀測定；土壤全磷質量分數采用鉬銻抗比色法測定；土壤有效磷質量分數采用NaHCO3浸提比色法測定；土壤全鉀、速效鉀質量分數采用火焰光度計法測定。

磷脂脂肪酸分析法的提取過程和分析方法主要參考Bossio[15]和劉波等[16]提出的方法。稱取相當于8 g干土的新鮮土樣，加入緩沖液經震蕩、抽提、濃縮等環(huán)節(jié)，再經有機溶劑抽提，以19:0甲酯為內標進行測定[17]。PLFAs的檢測采用美國MIDI公司生產的微生物自動鑒定系統(tǒng)（Sherlock Microbial Identifica-tion System Sherlock MIS4.5）進行，電子轟擊電離源（EI）到質譜檢測，峰面積通過計算機自動積分。

本研究用PLFAs總量表示土壤微生物總生物量，細菌的生物量可以通過 i15∶0，a15∶0，15 ∶ 0，i16 ∶ 0，16 ∶ 1ω9，16 ∶ 1ω7t，i17∶ 0，a17∶ 0，17∶ 0，18∶ 1ω7，cy19:0的PLFAs 的總含量進行估算，放線菌的生物量用10Me16∶0、10Me17∶0、10Me18:0的含量來估算；可用16∶0（10Me），17∶0（10Me），18∶ 0（10Me），i15∶ 0，a15∶ 0，i16∶ 0，i17 ∶ 0 和 a17 ∶ 0 的 總 含 量 來 估 算 革 蘭 氏 陽性 菌 的 含 量 ，可 用 16 ∶ 1ω5，16 ∶ 1ω7 t，16∶ 1ω9，cy17∶ 0，18∶ 1ω5，18∶ 1ω7 和cy19∶0 的總含量來估算革蘭氏陰性菌的含量[18]。

土壤微生物總DNA提取采用美國強力土壤試劑盒（MOBIO12888），按照說明書的操作步驟進行提取。將提取出的土壤微生物總DNA溶解在100 μL 去離子水中，取5 μL的DNA用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（0.5×TAE緩沖液），分析DNA的完整性和相對濃度并由測序公司進行高通量測序。細菌16S擴增引物采用通用引物（338F/806R）。根據 barcode 標簽序列和前引物序列篩選出有效序列后，將測序接頭與barcode序列去除，并對處理后的有效序列進行數據統(tǒng)計。用mothur和chopseq對所得序列進行分析，以97%相似性為標準劃分操作分類單元。將優(yōu)化序列根據silva庫中的參考序列對 OTU 進行分類鑒定。在綱（classis）的水平上做樣品群落分布柱狀圖，比較4個土壤環(huán)境中的細菌分布情況[19]。

1.3　數據處理

不同林型土壤理化性質、PLFAs含量、生態(tài)學指數的顯著性分析采用單因子方差分析（ANOVA）和最小顯著差數法（LSD），不同林型土壤特征對土壤細菌微生物量和群落組成的影響采用R語言中的線性冗余分析（RDA）。用Coverage表示測序深度指數，分別用Ace和Chao1指數表示細菌群落豐度，用Simpson和Shannon指數表示細菌群落物種的豐富度和多樣性；以上指數用mothur進行分析。

2　結果與分析

2.1　土壤理化性質

通過表1可以看出，4個林型不同土壤類型間的土壤含水率隨海拔升高而降低并存在顯著性差異，其中A林型含水率最大，接近90%，趨向飽和狀態(tài)；B林型居中，C林型和D林型無顯著性差異。從pH值可以看出各林型土壤均為酸性，其中B林型土壤pH值酸性最強并與其他3個林型存在顯著性差異。4個林型其土壤各個營養(yǎng)元素之間存出現不同程度的顯著性差異。土壤全氮、堿解氮A林型最高并明顯高于其它各林型，土壤全氮隨海拔升高而降低。全磷各林型差距不大，隨海拔升高而降低并存在顯著性差異。有效磷A林型明顯高于其它并存在顯著性差異。土壤全鉀和速效鉀含量B林型較低，4個林型無明顯分布規(guī)律。土壤有機碳A林型最高，B林型最低。

表 1　不同林型土壤理化性質?Table 1　Soil physical and chemical characteristics in different forest types

2.2　土壤細菌群落脂肪酸特征

通過磷脂脂肪酸生物標記分析（見表2），可以看出興安落葉松4種林型土壤細菌群落PLFAs種類豐富，含有多種飽和、不飽和、分支和環(huán)狀的磷脂脂肪酸的生物標記。試驗共檢測出C12～C20共44種PLFAs生物標記（表2）。磷脂脂肪酸生物標記在4個林型中土壤中分布為不完全分布類型，磷脂脂肪酸種類、含量（表2）以及各菌群總含量（見表3）均存在差異。D林型含有42種PLFAs，A和B數量相同含有41種，C林型含有38種。磷脂脂肪酸總量A林型最高，為1 869 μg/g；C 林型最低，為 1 085 μg/g；各林型之間存在顯著性差異。

將磷脂脂肪酸中的主要類群（Ba、Gp、Gn、Ac）進行統(tǒng)計和分析（表3），可以看出4個林型土壤中細菌（Ba）含量最大，革蘭氏陰性菌（Gn）次之，放線菌（Ac）含量最少。PLFA細菌總量和細菌（Ba）含量A林型最高，B林型和D林型次之，C林型最低。革蘭氏陽性菌（Gp）含量D林型最高，C林型最低。革蘭氏陰性菌（Gn）含量A林型最高，C林型最低。各樣地中革蘭氏陰性菌含量多于革蘭氏陽性菌含量，比值大于1，說明革蘭氏陰性菌占主要優(yōu)勢。

表 2　土壤細菌群落磷脂脂肪酸生物標記分析?Table 2　Analysis of PLFAs biomarkers related to the soil bacterial communities

采用Sat/Mon（飽和直鏈脂肪酸與單烯飽和脂肪酸含量之比）、Gp/Gn（革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌PLFAs含量之比）來分析不同微生物類型的相對含量。結果發(fā)現（表3），Sat/Mon比值各林型中蘚類興安落葉松林最高并依次降低，具有顯著性差異。Gp/Gn比值各林型土壤的比較發(fā)現，除草類興安落葉松林之外比值均小于1，說明除了該林型之外各林型中Gp含量少于Gn，革蘭氏陰性菌占絕對優(yōu)勢；其中草類興安落葉松林最高為1.123 8，杜香興安落葉松林最低為0.669 4，各林型間Gp/Gn比值存在顯著性差異。

表 3　土壤細菌磷脂脂肪酸含量?Table 3　PLFAs contents of bacteria in soils　　　(μg/g)

2.3　土壤細菌測序結果分析

土壤樣品原始序列條數為51 080，通過優(yōu)化過濾低質量序列后得到有效序列總數為45 763。供試土壤樣品序列經拆分、去冗余后在97%相似度下進行OTU聚類，共得到1 188個OTU。各林型OTU數目A最低并與其它三組存在顯著性差異，為174，B、C、D分別為338、336、340。如圖1所示，不同類型土壤的樣品稀釋性曲線均趨向平緩，但尚未呈現飽和；這說明了供試樣品取樣合理，測試數據量合理，實際土壤細菌群落結構置信度較高，能夠真實的反應土壤樣本的細菌群落組成結構，但可能還有一些少量的土壤細菌沒有被發(fā)現。

圖1　相似度為0.97條件下各土壤樣品的稀釋性曲線Fig.1　Rarefation curves of each soil sample at cutoff level of 3%

Coverage指數表示各樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低。該指數實際反映了本次測序結果是否代表樣本的真實情況。如表4所示，不同類型土壤環(huán)境樣品測序的coverage指數A最高為0.995，B、C、D為0.994。說明本試驗的測序結果能夠準確的反映供試土壤樣品的真實情況，這與稀釋性曲線顯示的結果相一致。

Ace指數和chao1指數是用來估計群落中OTU數目的指數，是生態(tài)學中估計生物物種總數和菌群豐富度的常用指數。如表4所示，不同林型土壤細菌的Ace指數和chao1指數C＞D＞B＞A，B、C、D與A存在顯著性差異。說明B、C、D林型中的土壤細菌總數和菌群豐度較高，而A林型最較低。

用Shannon指數和Simpson指數來估算供試土壤樣品中微生物的alpha多樣性。Shannon指數D＞B＞C＞A，Simpson指數值D＞B＞C＞A，說明B、C、D林型土壤細菌群落的信息量最大且復雜程度最高，而A林型土壤細菌群落的均勻度較高。

表 4　相似度為0.97條件下各土壤樣品多樣性指數Table 4　Diversity index of each soil sample at cutoff level of 3%

測序共獲得19門35綱55目87科92屬細菌。圖2所示，在綱分類水平上分屬于5個主要類群，主要包括變形菌Alphaproteobacteria、γ-變形菌Gammaproteobacteria、酸桿菌Acidobacteria、β變形菌Betaproteobacteria、放線菌Actinobacteria。γ-變形菌各林型樣品中的豐度為2.4%～41.61%，在A林型中為最優(yōu)勢菌門，表現出明顯的優(yōu)勢地位。變形菌在所有樣品中的豐度為12.95%～33.78%，在B、C、D林型中為最優(yōu)勢菌門。

在綱的分類水平上，A林型中共獲得17綱細菌，其中γ-變形菌相對豐度最高，為41.61%，為該林型的優(yōu)勢菌；其余相對豐度較高的依次為β變形菌（24.57%）、變形菌（12.95%）、酸桿菌（11.57%）。B林型中共獲得28綱細菌，其中變形菌相對豐度最高，為33.78%，為該林型的優(yōu)勢菌；其余相對豐度較高的依次為酸桿菌（13.51%）、放線菌（11.06%）。C林型中共獲得32綱細菌，其中變形菌相對豐度最高，為26.29%，為該林型的優(yōu)勢菌；其余相對豐度較高的依次為放線菌（11.94%）、β-變形菌（10.13%）、γ-變形菌（10.05%）。D林型中共獲得28綱細菌，其中變形菌相對豐度最高，為21.9%，為該林型的優(yōu)勢菌；酸桿菌含量為20.51%，為次優(yōu)勢菌。在屬分類水平上各土壤環(huán)境中優(yōu)勢菌不相同，共有菌相對豐度也不同，說明不同類型土壤細菌組成和群落結構存在差異（P＜0.05）。

圖2　綱分類水平下的微生物群落組成Fig. 2　Composition of bactetial community at class level

2.4　土壤理化性質對土壤細菌的影響

從圖3可以看出，冗余分析結果表明有效磷對土壤細菌生物量的影響較大，與土壤細菌Ba、革蘭氏陽性菌Gp、革蘭氏陰性菌Gn、放線菌Ac呈負相關。β-變形菌Betaproteobacteria和γ-變形菌Gammaproteobacteria與土壤pH值、有機碳、全氮、堿解氮、土壤含水率正相關，與全鉀、速效鉀負相關。變形菌Alphaproteobacteria和放線菌Actinobacteria與全磷和有效磷正相關。酸桿菌Acidobacteria與有效磷負相關。蘚類興安落葉松林（A）分布在X正半軸上，其土壤細菌群落結構與其它3個林型差異較大；草類興安落葉松林（C）和杜香興安落葉松林（B）分布在第三象限，與杜鵑興安落葉松林（D）的土壤細菌群落結構也存在較大差異；相比之下4個林型中，杜香興安落葉松林（B）與草類興安落葉松林（C）土壤細菌群落結構差異較小。

圖3　不同林型土壤理化性質與土壤微生物群落結構的RDA排序結果Fig. 3　RDA ordination of soil microbial compositionand soil physical and chemical characteristics

3　討　論

3.1　土壤細菌微生物量

有研究表明，不同林型的土壤微生物群落結構特征存在差異[20]，土壤理化性質能夠影響土壤微生物量和群落結構[21]，其中土壤含水率[22]、土壤pH值[23]、土壤養(yǎng)分含量[24-25]等為重要影響因子。本研究中，興安落葉松4種不同林型土壤細菌的微生物量群落結構分布明顯不同，所測試的土壤細菌總量、革蘭氏陽性菌總量、革蘭氏陰性菌總量隨土壤含水率升高而升高，這說明了濕潤的土壤能夠提高微生物的活性，從而增加微生物量，并影響微生物的群落結構[26]。細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌含量在土壤pH值、土壤有機質、全氮、堿解氮含量最高的蘚類興安落葉松林中最高，這可能與細菌喜好較高pH值和高有機質的土壤環(huán)境有關[27-28]。

飽和直鏈脂肪酸/單烯飽和脂肪酸比(Sat/Mon)，革蘭氏陽性菌/ 革蘭氏陰性菌(Gp/Gn)是描述環(huán)境脅迫下土壤微生物群落結構狀況的主要指標[29]。本研究中4個林型土壤微生物Sat/Mon比值隨全氮、全磷、土壤有機碳含量升高而增大且比值均大于1，這與Carrasco[30]等認為的Sat/Mon值小于1含有較高有機質含量的結果相反。Gp/Gn比值除草類興安落葉松林之外均小于1，表明Gp含量少于Gn，Gn占主導，說明這些地區(qū)容易分解的有機物含量較高[29]。同時Gp/Gn值隨土壤全鉀和速效鉀升高而增大，產生該結果的原因有待進一步研究。

此外，有研究指出土壤細菌群落與地表苔蘚類、泥炭層[31]的厚度密切相關。本研究中蘚類興安落葉松林的地表植被為苔蘚層、泥炭層所覆蓋，該區(qū)域中的特征磷脂脂肪酸，如一般性、非特異性細菌16:00含量最高，這與林英華等[27]的研究結果相一致。一般飽和脂肪酸14:00和單烯不飽和脂肪酸16∶1w9c屬于常見細菌的特征脂肪酸，在4個林型中均顯示出隨有機質含量的變化而變化，可能與可利用的碳源有關[32]。

3.2　土壤細菌結構和多樣性

有研究指出[33]土壤中變形菌門相對豐度在10%～77%之間，平均豐度為39%，酸桿菌門相對豐度在5%～46%之間，平均豐度為20%，疣微菌門相對豐度在0～21%之間，平均豐度為7%。本研究中變形菌門、酸桿菌門、疣微菌門相對豐度均在該范圍內，這與Shen等[34]對長白山森林主要土壤細菌豐度 (變形菌49.6%、酸桿菌18.7%、放線菌12.8%、疣微菌0.17% )的研究結果相類似，但與白曉旭等[35]對寶天曼森林土壤細菌豐度（變形菌29.0%、酸桿菌18.5%、疣微菌10.0%）的研究結果差別很大。造成該差異的原因可能來自于變形菌門中的β變形菌綱的豐度變化（大興安嶺11.46%，長白山18.6%，寶天曼5.6%）[35]，其豐度可能受pH值（長白山和大興安嶺平均pH值在5以上，明顯高于寶天曼的2.4～4.5）和土壤養(yǎng)分等環(huán)境因子影響[36]。

4種不同林型土壤細菌種類分布明顯不同，存在很多差異性類群。蘚類興安落葉松林與其他3個林型顯示出較大差異，蘚類興安落葉松林以γ-變形菌為主要優(yōu)勢菌群，而其他3個林型以變形菌為主要優(yōu)勢菌群，這與相關研究結果相似[37-38]，但是與李新等[39]研究認為的變形菌為鹽堿土壤或堿性土壤中主要類群的研究結果不相同。

土壤細菌的生物量和群落結構具有高度的復雜性，生物地理學研究者認為經緯度是影響其差異的重要因素[40-41]，也有學者認為土壤環(huán)境、立地條件、地上植被等[42-43]是其影響的重要因素。本研究中，4個林型中土壤細菌微生物量和群落結構規(guī)律性不強，特別是蘚類興安落葉松林的多項數據與其它3個樣地相差較大，這可能與該林型所處的特殊地理位置有關。蘚類興安落葉松林處于山坡底部，水分含量接近飽和狀態(tài)且土壤層下部存在永凍層，地上植被多以泥炭蘚為主，腐殖質層厚。從研究結果看，土壤含水率、土壤養(yǎng)分含量高，這可能是造成蘚類興安落葉松林的特殊性和研究結果規(guī)律性不顯著的原因。基于前期對興安落葉松林不同林型真菌的研究結果和本次對土壤細菌的群落結構和微生物量的研究，課題組已對大興安嶺寒溫帶興安落葉松林土壤微生物有了初步認識，下一步將在25 hm2永久性固定監(jiān)測樣地進行區(qū)域尺度的土壤微生物群落結構的監(jiān)測研究。

4　結　論

（1）磷脂脂肪酸法測試結果表明興安落葉松林中4個林型的土壤細菌微生物量和群落組成存在較大差異，其中蘚類興安落葉松林與其它3個林型表現出明顯不同。

（2）通過測序，共獲得19門35綱55目87科92屬土壤細菌。在綱分類水平上分屬于5個主要類群，主要包括變形菌Alphaproteobacteria、γ-變形菌Gammaproteobacteria、酸桿菌Acidobacteria、β變形菌Betaproteobacteria、放線菌Actinobacteria。

（3）冗余分析表明，土壤細菌微生物量和群落組成受土壤環(huán)境和土壤養(yǎng)分影響程度不同。有效磷對土壤細菌生物量的影響較大，土壤pH值、土壤含水率和土壤養(yǎng)分對土壤細菌的群落組成影響比較明顯。