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    納米銀影響桑樹(shù)組培苗生長(zhǎng)的原因初探*

    2018-07-13 05:41:46謝川星趙振嫻熊本華諶倫富談文輝王茜齡杜華茂
    蠶學(xué)通訊 2018年1期
    關(guān)鍵詞:納米銀桑樹(shù)桑葉

    謝川星 趙振嫻 熊本華 諶倫富 談文輝 王茜齡 杜華茂

    (1. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,重慶 400715,2. 重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院,重慶 400716)

    納米銀 (Silver nanoparticles, SNP)是粒徑為1-100nm的金屬銀單質(zhì),可由物理法、化學(xué)法或生物法等多種方法制備而成[1]。納米銀對(duì)大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體乙肝病毒、流感病毒等數(shù)百種致病微生物都有強(qiáng)烈的抑制和殺滅作用,而且不易產(chǎn)生耐藥性[2-3]。近30年來(lái)含納米銀的織物、日用品、衛(wèi)生用品、工業(yè)用品及醫(yī)療器械等發(fā)展異常迅猛,全球全年納米銀年產(chǎn)量約220-320t,產(chǎn)值達(dá)0.79-2.54億美元[4]。隨著納米銀的大量生產(chǎn)與廣泛應(yīng)用,排放到環(huán)境中的納米銀也與日巨增,如果在土壤和自然水體中富積,對(duì)環(huán)境微生物及植物可能產(chǎn)生毒副作用。Qin(2010)報(bào)道水蚤暴露在含納米銀的水體中24h與48h的半數(shù)致死劑量分別為3.56μg/L,1.75μg/L,0.5μg/L即可影響水蚤的繁殖[5]。納米銀進(jìn)入土壤后會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生影響,改變微生物的多樣性與分布特點(diǎn),原因在于不同微生物對(duì)納米銀的耐受性不一致,比如氨基氧化性古細(xì)菌比細(xì)菌更敏感;而細(xì)菌中,酸桿菌門和疣微菌門比其它細(xì)菌更敏感[6]。土壤中納米銀對(duì)植物的結(jié)構(gòu)、生理生化特性、生物量也會(huì)產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)。Barrena 等研究發(fā)現(xiàn)100mg/L 納米銀(粒徑 29nm)處理可抑制黃瓜和生菜的種子萌發(fā)[5]。Stampoulis 等研究發(fā)現(xiàn),納米銀濃度為 100mg/L、500mg/L 時(shí),西葫蘆生物量和蒸騰作用較空白組分別下降 41%和57%[7]。Dimkpa 等研究發(fā)現(xiàn),納米銀(粒徑 10 nm)顯著降低小麥芽和根的長(zhǎng)度,且降低程度與加入納米銀的濃度有關(guān)[3]。黑麥草種子暴露于 40mg/L 濃度的納米銀溶液中,其根系很難生長(zhǎng)根毛,根尖細(xì)胞高度液泡化,且觀察到表皮有破碎的細(xì)胞。以往的研究表明,納米銀的環(huán)境毒性與植物毒性是濃度依賴性的。

    近年有研究報(bào)道利用納米銀預(yù)防家蠶的細(xì)菌性、病毒性傳染病,取得較好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[7-9]。如果該法可行,納米銀將通過(guò)蠶沙進(jìn)入自然環(huán)境,特別是桑園。因此,本研究利用盆栽試驗(yàn),在土壤中按20mg/Kg, 40mg/Kg (土壤干重)添加納米銀,初步分析納米銀對(duì)土壤微生物及移栽桑苗生長(zhǎng)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    桑樹(shù):嘉陵30號(hào)組培苗,2017年10月移栽入土。

    納米銀購(gòu)于重慶新位點(diǎn)生物科技有限公司,粒徑20-40nm占80%。

    丙酮、硝酸、高氯酸、愈創(chuàng)木酚、硝酸鉀、異丙醇、對(duì)氨基苯磺磷酸、α-萘胺(購(gòu)于薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)、三氯乙酸、過(guò)氧化氫等藥品購(gòu)于重慶化學(xué)試劑廠。

    1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道土壤中納米銀含20mg/Kg對(duì)黑麥草[5]作物有促進(jìn)生長(zhǎng)作用,濃度大于20mg/Kg則表現(xiàn)出毒性,因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)20mg/Kg 、40mg/Kg兩個(gè)濃度分析納米銀對(duì)桑樹(shù)生長(zhǎng)的影響。土壤經(jīng)高壓滅菌后干燥稱重,加入納米銀并混勻,加自來(lái)水至合適的濕度,2018年1月19日栽種4月齡的桑樹(shù)組苗,每組4株,放于28℃溫室,每天光照10h,定期澆水,2018年3月中旬轉(zhuǎn)至室外。觀察桑樹(shù)的生長(zhǎng),4個(gè)月后測(cè)定桑葉葉片中葉綠素含量、過(guò)氧化氫酶(CAT),POD、硝酸還原酶等的酶活性;桑葉葉片,桑樹(shù)木質(zhì)部、韌皮部及根部納米銀含量;以及土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。

    1.3 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測(cè)定

    采用稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。細(xì)菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,放線菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基(加兩滴0.5%重鉻酸鉀),真菌于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(加34mg/mL氯霉素)

    10g土壤樣品倒入裝有90mL無(wú)菌水的250mL的三角瓶中(裝有玻璃珠),置于搖床上(120r/min,常溫),振蕩20min,使土壤充分分散成為土壤懸液。用滅菌生理鹽水作用10倍系列稀釋度。各稀釋度取0.1mL分別涂布三種培養(yǎng)基,每種三個(gè)重復(fù)。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)1-3d;真菌于25℃培養(yǎng)3-5d;放線菌于28℃培養(yǎng)4-7d。選取菌落數(shù)在10-300之間的平板計(jì)數(shù)。土壤中菌落數(shù)按公式計(jì)算。

    菌落數(shù)/g土壤(CFU·g-1) = 計(jì)數(shù)皿平均菌落數(shù) ×稀釋倍數(shù)/10。

    1.4 納米銀的含量測(cè)定

    分別取桑葉葉片、桑樹(shù)木質(zhì)部、韌皮部及根部,烘干粉碎。稱取0.5g烘干的樣品置于消化管中,加5mL 65%硝酸,于室溫硝化過(guò)夜。將樣品轉(zhuǎn)至燒杯中,加入2mL 30%過(guò)氧化氫,在通風(fēng)廚中于加熱板上消解至接近干,用2%的硝酸定容至5mL。

    配制納米銀標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為:0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL、1μg/mL,用火焰原子吸收分光光度計(jì)(ZA3300)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及各樣品的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并換算出各樣品納米銀含量。

    1.5 酶活性測(cè)定

    1.5.1酶液的提取

    稱取剪碎混勻的桑葉葉片0.3g置與預(yù)冷的研缽中,加入適量預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液(共6mL,分兩次加入)和少量石英砂冰浴研磨成勻漿后,于離心管中,在4℃、15000g下離心15min,上清液即為酶粗提液。

    1.5.2POD酶活性的測(cè)定

    按G.QIN等[5]采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行。主要步驟為各取上清液80μL,分別加入3mL反應(yīng)液(300mL的0.05mol/L磷酸緩沖液,168μL愈創(chuàng)木酚,1.704mLH2O2pH7.0),測(cè)定3min內(nèi)470nm吸光值,按 下列公式計(jì)算酶活性。

    POD活性(U·g-1·min-1·FW) =ΔD470×VT/(W×VS×0.01×t)

    其中,ΔD470 —反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化,以,W—植物鮮重,g;Vs—測(cè)定時(shí)所用酶液體積,mL;VT—提取酶液總體積,mL;t—反應(yīng)時(shí)間,min。

    1.5.3過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定

    各組取2mL酶粗提液于沸水浴2min以滅活過(guò)氧化氫酶,作為對(duì)照。取0.1mL酶粗提液,加1mL Tris-HCl,1.7mL去離子水,于25℃水浴中預(yù)熱3min,再加入0.2 mL 0.2mol/L H2O2溶液,混勻后立即測(cè)定A240值,每隔30s讀數(shù)一次,持續(xù)測(cè)定3min。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。以1min內(nèi)A240降低0.1的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。按下列公式計(jì)算酶活。

    CAT活性(U·g-1·min-1·FW) =(A240 control-A240 test)×V1/(W×V2×0.1×T)

    V1:提取酶液的總體積,單位為mL;W:植物鮮重(g);V2:測(cè)定時(shí)所用酶液體積(ml); T:反應(yīng)時(shí)間(min)。

    1.5.4硝酸還原酶活性的測(cè)定

    分別取各組葉片,用蒸餾水洗凈、濾紙吸干、剪碎。稱取0.3g放入試管。加入9mL反應(yīng)液(稱3.03g KNO3溶于300mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液中,再加3mL異丙醇)。各組設(shè)一對(duì)照,加1mL三氯乙酸使酶失活。

    將所有試管放入真空干燥器中、避光,反復(fù)抽氣直至葉片沉至管底,將各試管于30℃避光保溫30min。加1mL三氯乙酸,搖勻終止酶反應(yīng)。靜止2min,吸取上清液2mL加入另一試管,加 4mL 1%磺胺和 0.2%a-萘胺,60℃水浴保溫20min,測(cè)定A540值。

    按公式計(jì)算活活性:硝酸還原酶活性(U)=C×V1/(V2×W×T)

    C:反應(yīng)液催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量(μg),V1:提取酶液時(shí)加入的緩沖液體積(mL),V2:酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積(mL),W:樣品質(zhì)量(g),T:反應(yīng)時(shí)間(h)。

    1.6 葉綠素含量的測(cè)定

    稱取新鮮葉片0.1g,剪成細(xì)絲狀置于盛有10mL 80%丙酮的試管中,封口并用錫箔紙包裹試管。置于黑暗條件下至組織完全變白(大概要一周左右)。分別測(cè)定A663、A645、A652,按方式計(jì)算葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)的量,葉綠素總量(CT)= Chla+Chlb。

    Chla=12.72A663-2.59A645;Chlb=22.88A645-4.67A663

    1.7 統(tǒng)計(jì)分析

    本試驗(yàn)中三個(gè)組土壤中微生物含量、桑樹(shù)不同組織納米銀含量、桑葉的過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、硝酸還原酶的活性、葉綠素含量以及均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用軟件SPSS19.0選用LSD進(jìn)行多重比較,P<0.05,P<0.01分別表示差異顯著、差異極顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 納米銀對(duì)桑樹(shù)生長(zhǎng)的影響

    在溫室中1個(gè)月后,低濃度納米銀組(20mg/kg土壤)桑樹(shù)開(kāi)始發(fā)芽,隨后是對(duì)照組,高濃度納米銀組(40mg/kg土壤)桑樹(shù)發(fā)芽最晚。轉(zhuǎn)至室外生長(zhǎng)后,對(duì)照組桑樹(shù)的長(zhǎng)勢(shì)逐漸超過(guò)低濃度組,到第4個(gè)月,可見(jiàn)納米銀組桑樹(shù)葉片薄、質(zhì)軟,逐漸枯黃(見(jiàn)圖1)。最終,添加納米銀的實(shí)驗(yàn)組的株高、基徑、葉片數(shù)和總?cè)~面積都比對(duì)照組差,但因桑樹(shù)苗株高不一致,未對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。40mg/kg組桑樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)最差,移栽后5個(gè)月出現(xiàn)枯萎死亡。

    圖1 納米銀對(duì)桑樹(shù)生長(zhǎng)的影響

    2.2 納米銀對(duì)土壤微生物菌群的影響

    我們分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(含氯霉素)、高氏一號(hào)培養(yǎng)基(含重鉻酸鉀)培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,納米銀對(duì)放線菌影響最大,每克土壤放線菌數(shù)量從32萬(wàn)下降至13萬(wàn)和9萬(wàn),分別減少了57%和72%。其次是細(xì)菌,每克土壤總細(xì)菌量從4.15萬(wàn)下降至1.30萬(wàn)和1.50萬(wàn),分別減少了69%和63%。每克土壤真菌從1.20萬(wàn)下降至0.85萬(wàn)和0.51萬(wàn),分別減少了30%和58%(見(jiàn)圖2)。從結(jié)果可以看出土壤中納米銀濃度超過(guò)20mg/Kg對(duì)微生物的多樣性在一定的破壞作用。

    2.3 桑樹(shù)中納米銀的分布

    本研究中兩實(shí)驗(yàn)組人工添加納米銀至20mg SNP/kg土壤,40mg SNP/kg土壤,因長(zhǎng)時(shí)間在室外放置,約一半納米銀隨雨水流失,最后測(cè)定對(duì)照組含量為1.467mg/kg,8.289mg/kg,17.614mg/kg。對(duì)桑樹(shù)根、木質(zhì)部、韌皮部和葉片的銀含量測(cè)定結(jié)果顯示:20mg SNP/kg土壤組比對(duì)照組略高,但無(wú)顯著性差異,且葉片中均未檢出。除木質(zhì)部外,20mg SNP/kg土壤組顯著高于對(duì)照組,葉片中納米銀含量為0.8μg/g,根和韌皮部均達(dá)到1.3μg/g (圖3)。

    圖2 納米銀對(duì)土壤微生物的影響

    圖3 納米銀在桑樹(shù)不同組織中的分布

    2.4 納米銀對(duì)桑葉葉片中酶活性及葉綠素含量的影響

    將組培桑樹(shù)苗移栽4個(gè)月后取桑葉進(jìn)行過(guò)氧化氫(POD),過(guò)氧化物酶(CAT)和硝酸還原酶的活性測(cè)定,結(jié)果表明土壤中的納米銀導(dǎo)致桑葉抗氧化酶的活性上升,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的POD分別是對(duì)照組的2.1倍、3.4倍, CAT是對(duì)照組的1.7倍、2倍;但是,硝酸還原酶活性下降5.0-8.7倍,土壤納米銀濃度越高,桑葉中酶活變化越大(見(jiàn)表1)。說(shuō)明納米銀一方面刺激桑樹(shù)產(chǎn)生了活性氧,桑樹(shù)應(yīng)激性上調(diào)兩種抗氧化酶的表達(dá)以維持植株內(nèi)的氧化還原電勢(shì)平衡。硝酸還原酶是植物氮素同化過(guò)程的限速酶,該酶活下降說(shuō)明土壤中納米銀超過(guò)20mg/kg抑制氮的生物利用。

    表1 桑葉移栽4月后桑葉的酶活性與葉綠素含量測(cè)定結(jié)果

    注:同行數(shù)據(jù)的肩標(biāo)為不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著,相同字母或沒(méi)有字母表示差異不顯著。

    與對(duì)照組相比,土壤納米銀對(duì)桑樹(shù)葉綠素含量影響不顯著,濃度為20mg/kg 時(shí),葉綠素a、葉綠素b、稍有下降,但在40mg/kg濃度下總?cè)~綠素含量略有上升。

    3 討論

    土壤中銀含量水平極低,全球平均值僅為0.01-0.50mg/kg。從已有的資料,中國(guó)土壤中銀的平均水平達(dá)0.35mg/kg。由于工業(yè)行為,部分地區(qū)土壤中銀含量超過(guò)背景值3-50倍[10]。在本實(shí)驗(yàn)中采用的土壤中銀含量達(dá)1.46mg/kg。納米銀作為近三十年興起的新型抗菌材料,由于其出色的抗多種致病微生物能力,全球每年有約2.54億美元的產(chǎn)值[6]。因此,從生產(chǎn)環(huán)節(jié)或消費(fèi)終端釋放到環(huán)境中的納米銀引起了廣泛關(guān)注。進(jìn)入土壤的納米銀一部分隨雨水流失,一部份轉(zhuǎn)入深層土壤,在厭氧條件下轉(zhuǎn)化為納米AgS,而表層的納米銀較為穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的4個(gè)月期間,土壤中人工添加的納米銀減少了一半。從平板分離的三類微生物來(lái)看,20mg/kg納米銀對(duì)土壤微生物影響較大,數(shù)量顯著減少,放線菌最敏感,其次是細(xì)菌,40mg/kg納米銀影響更大。McGee等報(bào)道在10mg/kg條件下酸桿菌(Acidobacteia)下降了6%(在菌群的初始占比為15.4%),在50mg/kg濃度土壤中下降10%。某些菌的比例會(huì)上升,比如地發(fā)菌屬(Geothrix)增加了5%(初始占比為0.5%)。土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)影響土壤中脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶的活性,進(jìn)而影響物質(zhì)轉(zhuǎn)化和營(yíng)養(yǎng)循環(huán)。

    納米銀在桑樹(shù)不同組織的分布呈現(xiàn)差異,根>葉>莖,并隨土壤中濃度的增大而升高,這與盧揚(yáng)等測(cè)定外源銀離子在水稻中的分布趨勢(shì)相同。桑樹(shù)被認(rèn)為具有良好的修復(fù)土壤重金屬污染的能力。徐寧等報(bào)道,在贛州某地,隔、鉛、銅、鋅、砷超標(biāo)2-8倍的作物很生長(zhǎng),但桑樹(shù)不受影響,這些重金屬能在根、莖中富集以修復(fù)土壤。在實(shí)驗(yàn)條件下,土壤鎘含超過(guò)140mg/kg、鉛含量超過(guò)200mg/kg、坤含量超過(guò)160mg/kg時(shí)桑樹(shù)生長(zhǎng)受阻,1-2年后死亡,重金屬在根與莖中大量富集。在本研究中,土壤納米銀濃度超過(guò)40mg/kg就表現(xiàn)出明顯的抑制作用,3-4個(gè)月桑樹(shù)發(fā)育受阻并出現(xiàn)植株死亡,這可能與桑樹(shù)的株齡有關(guān),本實(shí)驗(yàn)采用4月齡的組培苗,抗性較弱。因此,今后可以對(duì)不同株齡的抗性差異展開(kāi)研究,以便于在治理重金屬污染的實(shí)踐中推廣應(yīng)用。

    納米銀抗菌作用及動(dòng)物細(xì)胞毒性作用的機(jī)理研究顯示,納米銀刺激產(chǎn)生大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS),ROS具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能,能破壞生物膜的完整性,損傷蛋白質(zhì)、脂類及核酸,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。生物已進(jìn)化出不同的抗氧化機(jī)制,比如,所有生物都有硫氧還蛋白,以維持內(nèi)環(huán)境的氧化-還原平衡[12]。本研究測(cè)得納米銀組桑葉中過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶的活性顯著高于對(duì)照組,就是因?yàn)榧{米銀所致;雖然20mg/Kg組桑葉與對(duì)照組一樣沒(méi)有測(cè)出納米銀,但在根與韌皮部納米銀含量高于對(duì)照組,所以葉片中兩種抗氧化酶活性增高。40mg/Kg組桑樹(shù)出現(xiàn)枯萎死亡,我們推測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力不足以消除ROS,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

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