TRAIL及其受體在PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞表達(dá)

李科　祁秀娟　呂映頻　譚慧芳　苗佳

[摘要]目的探討腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）及其受體死亡受體4（DR4）和誘騙受體1（DcR1）在多囊卵巢綜合征（PCOS）病人卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)及其與PCOS發(fā)病的關(guān)系。

方法收集PCOS病人30例及卵巢正常者（對照組）30例的卵巢顆粒細(xì)胞，RTPCR方法分析兩組TRAIL及其受體DR4、DcR1 mRNA表達(dá)情況，Western blot法檢測兩組TRAIL及其受體DR4、DcR1蛋白表達(dá)情況。

結(jié)果PCOS組TRAIL mRNA及蛋白表達(dá)較對照組明顯增加（t=2.641、2.891，P<0.01），DcR1 mRNA和蛋白表達(dá)較對照組明顯降低（t=2.039、3.079，P<0.01），兩組DR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無顯著性（P>0.05）。

結(jié)論P(yáng)COS病人卵巢顆粒細(xì)胞TRAIL及其受體異常表達(dá)，可能通過參與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控導(dǎo)致PCOS發(fā)病。

[關(guān)鍵詞]多囊卵巢綜合征；卵巢顆粒細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；死亡受體4；受體，腫瘤壞死因子，成員10c

[中圖分類號]R711.75

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02019706

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡婦女最常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，臨床以卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥、持續(xù)無排卵為主要臨床特征，多伴胰島素抵抗、肥胖等。其病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，隨著研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)凋亡是參與PCOS發(fā)病的重要病理過程。PCOS病人卵巢局部特征主要表現(xiàn)為卵泡閉鎖和持續(xù)不排卵，而凋亡是參與這些病理過程重要環(huán)節(jié)。大量研究顯示，卵泡的發(fā)育、閉鎖與顆粒細(xì)胞凋亡息息相關(guān)，PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡明顯增加，多種凋亡分子參與此過程，如Fas家族及Bcl家族[12]。接受體外受精胚胎移植（IVF）的PCOS病人往往產(chǎn)生較多的卵母細(xì)胞，但是，這些卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量差，導(dǎo)致妊娠率低和流產(chǎn)率高，而這些都可能與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）及其受體是參與凋亡的重要分子，表達(dá)于卵巢及人體多種組織[4]。已有研究顯示，TRAIL在PCOS模型大鼠及豬的卵巢顆粒細(xì)胞中影響卵泡發(fā)育[5]，由此可以猜測TRAIL及其受體可能參與PCOS病人顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育及妊娠結(jié)局。本文比較了PCOS病人和卵巢正常婦女卵巢顆粒細(xì)胞TRAIL及其受體表達(dá)差異，初步探討其參與PCOS發(fā)病的機(jī)制及與IVF結(jié)局的關(guān)系，為臨床治療PCOS提供實驗依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年8月—2017年4月就診于我院生殖中心行IVF的PCOS病人30例，PCOS診斷符合2013年美國內(nèi)分泌學(xué)會PCOS診療指南標(biāo)準(zhǔn)[6]。①卵巢多囊樣改變（一側(cè)或雙側(cè)卵巢2～9 mm大小的卵泡不低于12個，或卵巢體積>10 mL）；②排卵障礙：稀發(fā)排卵或無排卵；③存在雄激素分泌過多的臨床癥狀（多毛、痤瘡、脂溢性皮膚、毛孔變大、脫發(fā)等）和（或）生化指標(biāo)（血睪酮≥2.46 nmol/L或游離雄激素指數(shù)>5）。符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的2條可診斷為PCOS，且近3個月內(nèi)無糖皮質(zhì)激素等激素類藥物服用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有卵巢、子宮手術(shù)史；②合并其他導(dǎo)致不孕的疾病如子宮內(nèi)膜異位癥、高泌乳素血癥等；③有其他引起肥胖的疾病或相關(guān)藥物服用史者；④合并其他嚴(yán)重疾病者，如肝腎功能不全、癌癥、精神性疾病；⑤有吸煙、飲酒等不良嗜好；⑥有食物過敏史；⑦其他引起高雄激素血癥的疾病，如庫欣綜合征、分泌雄激素的腫瘤、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、應(yīng)用外源性雄激素等。選取卵巢功能正常單純因輸卵管原因不孕的病人30例作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，病人均知情同意。

1.2臨床資料收集

收集病人的臨床資料，包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、孕酮（P）、雌二醇（E2）、睪酮（T）、促甲狀腺激素（TSH）。檢測病人注射人絨毛促性腺激素（HCG）日內(nèi)膜厚度、HCG日1.4 cm以上卵泡個數(shù)、HCG日E2、Gn天數(shù)、Gn總量、優(yōu)胚率、獲卵數(shù)、形成胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（胚胎分級按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[7]）。

1.3儀器及試劑

全波長酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo Scientific公司）；FTC3000 SmartQ 熒光定量PCR儀（加拿大Funglyn Biotech 公司）；percoll淋巴細(xì)胞分層液（美國Sigma公司）；Trizol試劑（KaTaRa公司）；SYBRⅡ（KaTaRa公司）；透明質(zhì)酸酶（Sigma 公司）；鼠抗人GAPDH 抗體（美國 Abcam 公司）；兔抗人TRAIL、DR4、 DcR1 抗體（美國 Abcam 公司）；羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗（武漢博士德公司）。

1.4促排卵方案

根據(jù)病人基礎(chǔ)情況采用常規(guī)長方案或拮抗劑方案促排卵。用藥后根據(jù)激素水平及卵泡生長情況進(jìn)

[LL]行藥物調(diào)整，當(dāng)2～3個卵泡直徑≥18 mm時，當(dāng)日傍晚注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導(dǎo)下行取卵手術(shù)。

1.5卵巢顆粒細(xì)胞提取

采用文獻(xiàn)報道密度梯度離心法[8]收集卵巢顆粒細(xì)胞。取卵時收集所有大卵泡（>16 mm卵泡）液，以2 000 r/min離心10 min，沉淀物用PBS配成懸液，以1∶1的比例將細(xì)胞懸液緩慢加入體積分?jǐn)?shù)0.50 Percoll分離液中，以2 500 r/min離心20 min，吸取中間白色卵巢顆粒細(xì)胞層，加入PBS洗滌2次，用紅細(xì)胞裂解液洗滌、溶解紅細(xì)胞，再用PBS洗滌去除紅細(xì)胞裂解液，獲得卵巢顆粒細(xì)胞黏液團(tuán)，加入含1 g/L透明質(zhì)酸酶的滅菌磷酸緩沖液1 mL，37 ℃水浴孵育10 min后，1 800 r/min離心8 min；沉淀中加入PBS 10 mL，用300目細(xì)胞篩過濾后，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度后-80 ℃凍存。

1.6實時熒光定量PCR檢測TRAIL及其受體 DR4、 DcR1 mRNA表達(dá)

按Trizol說明書提取總mRNA，紫外線分光光度計檢測RNA純度及完整性，取吸光度（A260/A280）為1.8～2.0的樣本，嚴(yán)格按照說明書方法，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（KaTaRa公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80 ℃保存。TRAIL、DR4、DcR1引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。按SYBRⅡ說明書進(jìn)行TRAIL、DR4、DcR1 mRNA表達(dá)的檢測。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，40個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃變性30 s。采集熒光信號及熔解曲線進(jìn)行分析，應(yīng)用軟件計算各樣本的Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

1.7Western blot檢測TRAIL及其受體 DR4、 DcR1蛋白表達(dá)

取兩組卵巢顆粒細(xì)胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃離心提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；蛋白電泳轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，磷酸化兔抗人TRAIL 抗體（稀釋濃度1∶500）、兔抗人DR4抗體（稀釋濃度1∶1 000）、磷酸化兔抗人DcR1抗體（稀釋濃度1∶1 000）孵育過夜，PBST洗滌3次，相應(yīng)二抗（稀釋濃度1∶2 000）孵育2 h，PBST再次洗滌后顯影，掃描后BioRad Quantity One軟件分析灰度值，結(jié)果以待測蛋白與內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值表示。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用卡方檢驗；兩變量間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組一般資料比較

PCOS組與對照組年齡、基礎(chǔ)E2、FSH、BMI、P、TSH、Gn天數(shù)、HCG日內(nèi)膜厚度、優(yōu)胚率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；PCOS組基礎(chǔ)LH、T、HCG日E2、HCG日1.4 cm以上卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、形成胚胎數(shù)高于對照組，PCOS組Gn用量較對照組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.186～3.982，P<0.05）。見表2。

2.2兩組TRAIL及其受體mRNA表達(dá)比較

PCOS組卵巢顆粒細(xì)胞TRAIL mRNA相對表達(dá)量較對照組明顯增加，DcR1 mRNA相對表達(dá)量較對照組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.039、2.641，P<0.05）；DR4 mRNA相對表達(dá)量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.3兩組TRAIL及其受體蛋白表達(dá)比較

PCOS組TRAIL蛋白表達(dá)量較對照組增多，DcR1蛋白表達(dá)量較對照組減少，差異有顯著性（t=2.891、3.079，P<0.05）；兩組DR4蛋白相對表達(dá)量比較差異無顯著性（P>0.05）。見表3及圖1。

2.4兩組妊娠情況比較

PCOS組移植鮮胚14例，3例臨床妊娠（B超見妊娠囊），妊娠率為21%；對照組移植鮮胚24例，臨床妊娠13例，妊娠率為54%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.888，P<0.05）。進(jìn)一步比較對照組鮮胚移植妊娠婦女和未妊娠婦女TRAIL mRNA表達(dá)情況，妊娠婦女TRAIL mRNA相對表達(dá)量為0.31±0.07，較未妊娠婦女（0.46±0.11）低，差異有顯著性（t=3.730，P<0.05）。PCOS組凍胚移植22例，臨床妊娠10例，未妊娠婦女TRAIL mRNA相對表達(dá)量為0.59±0.15，較妊娠婦女（0.39±0.12）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.445，P<0.05）。

2.5相關(guān)性分析

PCOS組TRAIL mRNA相對表達(dá)量與獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)胚數(shù)均無相關(guān)關(guān)系（P>0.05），而與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.891，P<0.05）。PCOS組DcR1 mRNA相對表達(dá)量與獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率無相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。

3討論

在卵泡發(fā)育的微環(huán)境中，卵巢顆粒細(xì)胞不僅能為卵母細(xì)胞提供基礎(chǔ)營養(yǎng)，還能分泌有利于卵母細(xì)胞成熟的相關(guān)因子，因此，顆粒細(xì)胞在卵泡的生長過程中有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋

亡影響卵泡生長、發(fā)育[9]。PCOS以排卵功能異常

（包括卵泡發(fā)育異常、無優(yōu)勢卵泡）、卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕R床特征，而這些特征均與卵泡異常閉鎖有

關(guān)[10]。PCOS病人卵泡閉鎖異常機(jī)制不是很明確，目前學(xué)者認(rèn)為其與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，凋亡參與原始卵泡和初級卵泡的閉鎖生理過程[11]。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡還能造成雄激素堆積，過高濃度的雄激素進(jìn)入竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞，結(jié)合

到雄激素受體，可使顆粒細(xì)胞之間的間質(zhì)和多核糖小體減少，反過來造成卵巢顆粒細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生，如此形成惡性循環(huán)[1213]。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡包含兩條途徑：線粒體途徑和死亡受體途徑。死亡受體途徑是由死亡受體和配體結(jié)合引起的，如TRAIL及其受體、Fas及其配體FasL。線粒體途徑主要由Bcl2家族相關(guān)蛋白介導(dǎo)[14]。有研究顯示，PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡明顯增加，P53、Fas/FasL、Bcl/Bax等凋亡因子均參與PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[1518]。

TRAIL蛋白廣泛分布于人體多種組織中，如卵巢、胎盤、心臟、脾、腎、前列腺、骨骼肌等正常組織細(xì)胞中。TRAIL與其家族內(nèi)成員TNFα、FasL的作用機(jī)制相似，可以選擇性與其受體結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞等發(fā)生凋亡[19]。TRAIL受體主要包括死亡受體（DR4、DR5）、死亡誘騙受體（DcR1、DcR2）和骨保護(hù)素（OPG）等3類。TRAIL通過與死亡受體結(jié)合，經(jīng)caspase3參與，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而與死亡誘騙受體結(jié)合則無法將凋亡信息傳遞至胞內(nèi)，不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)細(xì)胞作用[2021]。因此，檢測卵巢顆粒細(xì)胞表面TRAIL及其受體的表達(dá)對了解TRAIL參與PCOS發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

本文研究結(jié)果顯示，PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞TRAIL mRNA和蛋白相對表達(dá)量較對照組增加，推測TRAIL在PCOS的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。DcR1對細(xì)胞可發(fā)揮保護(hù)作用，本文的結(jié)果顯示DcR1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量較對照組減少，提示PCOS病人Dcr1保護(hù)作用減弱，與張娟等[22]的研究結(jié)果相一致。本文結(jié)果還顯示，兩組間DR4 mRNA及蛋白表達(dá)差異無顯著性。推測在PCOS

病人卵泡發(fā)育過程中，TRAIL及其受體DcR1異常

表達(dá)導(dǎo)致凋亡過程紊亂，DcR1不能競爭性地阻止DR4/DR5與TRAIL結(jié)合，導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加，阻礙卵泡發(fā)育，最終導(dǎo)致無優(yōu)勢卵泡。另一方面，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致卵泡閉鎖異常，造成大量小卵泡的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致卵巢多囊樣改變。

凋亡除了參與卵泡發(fā)育過程，還能在妊娠過程中發(fā)揮重要作用。本文研究結(jié)果顯示，PCOS組鮮胚妊娠率明顯低于對照組，對照組鮮胚移植妊娠組TRAIL mRNA相對表達(dá)量較未妊娠組降低。遺憾的是PCOS組鮮胚移植的人數(shù)相對較少，未能進(jìn)行TRAIL mRNA相對表達(dá)量比較。但是通過比較PCOS組凍胚移植情況顯示，未妊娠婦女TRAIL mRNA表達(dá)量較妊娠婦女高，由此推測TRAIL可能通過卵巢顆粒細(xì)胞凋亡對PCOS病人妊娠產(chǎn)生影響。已有研究結(jié)果顯示，妊娠早期不伴PCOS的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病人胎盤組織TRAIL mRNA表達(dá)及血清sTRAIL均較自愿終止妊娠女性顯著增加，表明TRAIL在妊娠早期可能會增加流產(chǎn)的風(fēng)險[23]。關(guān)于TRAIL在妊娠中的具體作用機(jī)制目前還不夠清楚，有學(xué)者推測其機(jī)制可能是與子宮螺旋動脈的重建及子宮內(nèi)膜異常凋亡有關(guān)，從而影響胚胎著床導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[15，24]。本文相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PCOS組的TRAIL mRNA相對表達(dá)量與優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)，推測可能是由于TRAIL通過誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵子發(fā)育異常，從而影響胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局。但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，TRAIL及其受體DR4、DcR1均在PCOS病人卵巢顆粒細(xì)胞有表達(dá)，TRAIL及其受體DcR1的異常表達(dá)可能通過凋亡參與PCOS卵泡發(fā)育障礙及影響妊娠結(jié)局，但是具體的機(jī)制還有待研究。近期有研究顯示，敲除TRAIL基因的小鼠能誘導(dǎo)胰島素抵抗，推測TRAIL可能是通過調(diào)節(jié)參與葡萄糖代謝和胰島素信號傳導(dǎo)的基因表達(dá)來改善胰島素敏感性[2627]。雖然這個實驗沒有構(gòu)建PCOS模型，但是其為PCOS病人胰島素抵抗的研究開辟了新方向。目前有研究顯示，參與凋亡的TNFα和FasL通過誘導(dǎo)凋亡在胰島素抵抗發(fā)病過程中扮演重要角色[2728]。所以，TRAIL能否通過誘導(dǎo)凋亡參

與PCOS病人胰島素抵抗發(fā)病又是一個新的研究

方向。本實驗不足之處在于樣本數(shù)量不足，結(jié)果可能有一定偏差；并且由于TRAIL受體可能內(nèi)化到內(nèi)涵體中，單純用Western blot技術(shù)檢測受體蛋白的表達(dá)結(jié)果與實際情況可能有一定差異。

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