右美托咪定對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞低氧復(fù)氧損傷中線粒體分裂影響

孫鑫洲　張林　王士雷　李瑜　張殿隆　高清華

[摘要]目的探討右美托咪定對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞低氧復(fù)氧損傷中線粒體分裂的影響及其機(jī)制。

方法

原代培養(yǎng)出生24 h內(nèi)的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，采用氧糖剝奪法建立低氧復(fù)氧模型，隨機(jī)數(shù)字表法分成8組（n=6）：正常對(duì)照組（C組，不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理）、賦形劑組（V組，不進(jìn)行低氧復(fù)氧處理，加入體積分?jǐn)?shù)0.000 1的二甲亞砜培養(yǎng)6 h）、低氧復(fù)氧組（H/R組，采用氧糖剝奪法低氧6 h、復(fù)氧20 h，建立大鼠海馬神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷模型）、H/R+右美托咪定0.1 μmol/L組（D1組）、H/R+右美托咪定1.0 μmol/L組（D2組）、H/R+右美托咪定5.0 μmol/L組（D3組）、H/R+右美托咪定10.0 μmol/L組（D4組）、H/R+右美托咪定100.0 μmol/L組（D5組），D1、D2、D3、D4、D5組在低氧復(fù)氧期間分別加入終濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、100.0 μmol/L的右美托咪定，低氧6 h，復(fù)氧20 h。觀察各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量與形態(tài)，檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞活性、細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子熒光強(qiáng)度以及線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1和細(xì)胞色素C（CytC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的表達(dá)。

結(jié)果與C組比較，H/R組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量和活性明顯降低，鈣離子熒光強(qiáng)度、Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)均增高，差異有顯著性（F=221.10～816.00，P<0.05）；V組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與H/R組比較，D1、D2、D3組神經(jīng)元細(xì)胞活性升高，鈣離子熒光強(qiáng)度和Drp1、Fis1、CytC、AIF蛋白表達(dá)顯著降低，其中D2組降低更為明顯，差異有顯著性（F=221.10～816.00，P<0.05）。

結(jié)論右美托咪定能夠減輕低氧復(fù)氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，可能通過抑制線粒體分裂發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]右美托咪定；線粒體；低氧；海馬；神經(jīng)元

[中圖分類號(hào)]R971.3；R614.24

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)] 20965532（2018）02015606

臨床麻醉中常出現(xiàn)心臟停搏、休克、手術(shù)意外等急危重癥情況，易造成大腦缺血/再灌注（I/R）損傷，表現(xiàn)為不同程度的腦功能障礙，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率[1]。對(duì)應(yīng)用麻醉藥物時(shí)的腦保護(hù)研究一直都是臨床麻醉探索的熱點(diǎn)之一。丙泊酚和異氟烷都可以通過不同的機(jī)制減輕大腦I/R損傷[24]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體除作為細(xì)胞供能的細(xì)胞器以外，在細(xì)胞凋亡的過程中同樣起著重要的作用[5]。研究顯示，線粒體處在一個(gè)不斷分裂/融合的平衡狀態(tài)，而這種狀態(tài)的維持與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。I/R損傷可導(dǎo)致線粒體分裂增加，從而加重細(xì)胞凋亡[6]，抑制I/R損傷過程中的線粒體分裂過程，可以有效抑制細(xì)胞凋亡。研究顯示，右美托咪定可以通過抑制鈣離子內(nèi)流減輕腦I/R損傷[7]，但尚無(wú)研究探討右美托咪定是否可以通過作用于線粒體分裂來減輕腦I/R損傷。本實(shí)驗(yàn)旨在探討右美托咪定對(duì)腦I/R損傷過程中線粒體分裂的影響。

1材料和方法

1.1海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)

出生24 h之內(nèi)的SD大鼠（由青島市藥檢所動(dòng)物中心提供），用體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇消毒，在冰袋上摘取海馬組織，用2.5 g/L胰酶消化20 min。加入DMEMF12細(xì)胞種植液（美國(guó)Hyclone公司）終止消化20 min，用200目濾網(wǎng)對(duì)海馬細(xì)胞的消化懸液進(jìn)行過濾，然后離心。將獲得的海馬神經(jīng)元細(xì)胞種植在多聚賴氨酸（美國(guó)Sigma公司）包被過的培養(yǎng)瓶之中，加入種植液，放入培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，將原來的種植液吸出，換成含有NeurobasalA的培養(yǎng)液（美國(guó)Gibico公司）。每隔2～3 d根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行換液，培養(yǎng)至第8天。

1.2模型制備及分組

建立海馬神經(jīng)元細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型，以此模型模擬腦I/R損傷過程：將培養(yǎng)至第8天的神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)用無(wú)糖Earles液代替原培養(yǎng)液。培養(yǎng)6 h后，換回原培養(yǎng)條件進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)20 h。低氧復(fù)氧的過程中，在培養(yǎng)液中加入溶于體積分?jǐn)?shù)0.000 1二甲基亞砜（DMSO）的右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）。將海馬神經(jīng)元細(xì)胞按數(shù)字表法分成8組（每組6瓶）：正常對(duì)照組（C組，不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理）、賦形劑組（V組，不行低氧復(fù)氧處理，加體積分?jǐn)?shù)為0.000 1的DMSO培養(yǎng)6 h）、低氧復(fù)氧組（H/R組，采用氧糖剝奪法低氧6 h，復(fù)氧20 h，建立大鼠海馬神經(jīng)元低氧復(fù)氧損傷模型）、H/R+右美托咪定0.1 μmol/L組（D1組）、H/R+右美托咪定1.0 μmol/L組（D2組）、H/R+右美托咪定5.0 μmol/L組（D3組）、H/R+右美托咪定10.0 μmol/L組（D4組）、H/R+右美托咪定100.0 μmol/L組（D5組）。D1、D2、D3、D4、D5組在低氧復(fù)氧期間分別加入終濃度為0.1、1.0、5.0、10.0、100.0 μmol/L的右美托咪定，低氧培養(yǎng)6 h，復(fù)氧培養(yǎng)20 h。

1.3細(xì)胞活性測(cè)定

在96孔板中培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞。各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，移除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3次，根據(jù)細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明加入檢測(cè)溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.4細(xì)胞質(zhì)鈣離子熒光強(qiáng)度測(cè)定

用24孔板爬片培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞至第8天，各組細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，用Hanks液沖洗3次，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)試劑盒說明，每孔加入工作液100 μL，避光、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育45 min；移除工作液，用Hanks液沖洗細(xì)胞3次后，加入Hanks液100 μL，繼續(xù)避光、37 ℃孵育30 min。然后，移除Hanks液，以40 g/L多聚甲醛固定之后，在細(xì)胞爬片上滴入甘油防止猝滅，最后封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察鈣離子的熒光強(qiáng)度，用Image J軟件分析鈣離子熒光強(qiáng)度值。

1.5Western blot方法檢測(cè)線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1、Fis1和凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C（CytC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的表達(dá)

提取各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞蛋白，用BCA法檢測(cè)提取的蛋白濃度。配制相應(yīng)的分離膠和濃縮膠，對(duì)提取的蛋白質(zhì)分別電泳、轉(zhuǎn)膜2 h，再用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗鼠單克隆一抗Drp1（美國(guó)Milipore公司，1∶400）、小鼠抗大鼠單克隆一抗CytC（美國(guó)Milipore公司，1∶1 000）、兔抗鼠單克隆一抗AIF（美國(guó)Milipore公司，1∶1 000）以及小鼠抗大鼠單克隆一抗Fis1（美國(guó)Milipore公司，1∶

1 000），4 ℃孵育過夜。大約12 h之后，用PBS洗膜3次，每次約10 min。然后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Milipore公司，1∶5 000）孵育2 h，PBS沖洗4次，每次約5 min?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光，使用Image Pro軟件分析結(jié)果。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得計(jì)量資料結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，多組間均數(shù)比較若滿足正態(tài)分布以及方差齊性，則采用單因素方差分析，組與組之間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)；若多組數(shù)據(jù)間比較時(shí)方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)，組與組之間兩兩比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)并用Bonferroni法校正P值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組神經(jīng)元細(xì)胞活性比較

與C組比較，H/R組神經(jīng)元和突觸的數(shù)量明顯減少；與H/R組比較，D1、D2、D3組神經(jīng)元和突觸數(shù)量明顯增多，而D4、D5組神經(jīng)元和突觸數(shù)量明顯減少。C組和V組之間的細(xì)胞活性比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）；H/R組的細(xì)胞活性明顯低于C組和V組，D1、D2、D3組細(xì)胞活性明顯高于H/R組，而D4、D5組細(xì)胞活性低于H/R組，差異有顯著性（F=221.10，P<0.05）。見表1、圖1。由于D4、D5組右美托咪定處理細(xì)胞不但不會(huì)產(chǎn)生保護(hù)作用，反[LL]而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中舍棄了D4、D5組。

2.2各組細(xì)胞質(zhì)鈣離子熒光強(qiáng)度比較

V組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度與C組比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）；H/R組鈣離子熒光強(qiáng)度與C組相比明顯升高，D1、D2、D3組鈣離子熒光強(qiáng)度低于H/R組，D2組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度低于D1、D3組，差異有顯著性（F=816.00，P<0.05）。見表1。

2.3各組線粒體分裂和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

C組和V組比較，Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性（P>0.05）。與C組比較，H/R組Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)顯著增加；與H/R組比較，D1、D2、D3組Drp1、Fis1、CytC和AIF蛋白表達(dá)顯著降低；其中D2組4種蛋白表達(dá)降低最明顯，差異有顯著性（F=399.20～577.26，P<0.05）。見圖2、表2。

3討論

I/R模型線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的作用已經(jīng)成為右美托咪定神經(jīng)保護(hù)機(jī)制體外研究的重點(diǎn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)初步揭示了右美托咪定可能通過作用于線粒體內(nèi)部相關(guān)結(jié)構(gòu)或是干擾部分因子的釋放從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞I/R損傷過程中的凋亡[810]。目前，尚沒有研究探討右美托咪定對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用是否與線粒體分裂和融合之間的動(dòng)態(tài)平衡有聯(lián)系。

本文研究通過培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞采用氧糖剝奪法建立低氧復(fù)氧模型，作為大腦I/R損傷體外模型[1112]，探討右美托咪定對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在H/R損傷過程中的作用。本文研究結(jié)果顯示，0.1～5.0 μmol/L濃度的右美托咪定對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用，尤其1.0 μmol/L濃度右美托咪定的保護(hù)作用最明顯；隨著劑量的加大，當(dāng)右美托咪定濃度超過10.0 μmol/L時(shí)，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制作用。右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）能夠一定程度降低由于H/R損傷導(dǎo)致的線粒體內(nèi)過高的鈣離子熒光強(qiáng)度，對(duì)細(xì)胞凋亡起到部分抑制作用。對(duì)大鼠腦I/R損傷研究顯示，右美托咪定可以有效減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制為上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax、P53的表達(dá)，同時(shí)也對(duì)線粒體膜的通透性有一

定的降低作用，從而抑制CytC、AIF等凋亡相關(guān)因

[LL]子從線粒體釋放到胞漿中[1314]。線粒體在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，研究顯示線粒體其實(shí)是一個(gè)不斷進(jìn)行分裂融合的動(dòng)態(tài)細(xì)胞器[1518]，這種動(dòng)態(tài)過程主要表現(xiàn)為分裂和融合處于平衡且對(duì)立的狀態(tài)。線粒體分裂涉及兩種蛋白，分別是Drp1蛋白和Fis1蛋白[19]。有研究表明，Drp1 Ser637作為Drp1的磷酸化位點(diǎn)可以被鈣離子依賴性的鈣調(diào)磷酸激酶去磷酸化，從而促進(jìn)線粒體的分裂[20]。本文研究通過檢測(cè)線粒體裂變蛋白的表達(dá)，探討右美托咪定抑制H/R誘導(dǎo)的線粒體裂變對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

[HJ2mm]結(jié)果顯示，右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）可能通過降低H/R損傷時(shí)Drp1和Fis1的表達(dá)來抑制線粒體的分裂，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

線粒體在I/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用，CytC作為呼吸鏈中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)在線粒體凋亡途徑中起到非常關(guān)鍵的作用[2122]。AIF作為一種凋亡誘導(dǎo)蛋白，通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)的濃縮和線粒體膜除極影響細(xì)胞凋亡的過程[2324]。右美托咪定可以減少?gòu)木€粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的CytC

量，抑制細(xì)胞中caspase9、caspase3和caspase6的激活，使caspase依賴程序性細(xì)胞凋亡受到抑制， AIF的表達(dá)也降低[25]。本文研究結(jié)果顯示， 0.1～5.0 μmol/L濃度右美托咪定可降低CytC和AIF的表達(dá)，且1.0 μmol/L濃度右美托咪定是發(fā)揮腦保護(hù)的最佳濃度。推斷右美托咪定可能通過降低Drp1和Fis1的表達(dá)來抑制線粒體的分裂，進(jìn)一步降低CytC和AIF的表達(dá)，抑制H/R損傷過程中的細(xì)胞凋亡。綜上所述，右美托咪定可能通過抑制線粒體分裂減輕低氧復(fù)氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

鈣離子在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載能夠引起線粒體膜電位除極以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，從而誘導(dǎo)線粒體凋亡的發(fā)生[2627]。本課題組先前的研究結(jié)果表明，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（MCU）可以將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子轉(zhuǎn)入到線粒體基質(zhì)中[2829]，通過調(diào)節(jié)MCU可以降低腦I/R損傷過程中的鈣離子的攝取，起到腦保護(hù)的作用[30]。本文的研究結(jié)果還顯示，右美托咪定（0.1～5.0 μmol/L）降低Drp1和Fis1表達(dá)的同時(shí)伴隨著鈣離子熒光強(qiáng)度的降低，推測(cè)右美托咪定可能是通過抑制胞漿鈣超載誘導(dǎo)的線粒體膜電位除極和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，抑制線粒體凋亡 [31]。

雖然右美托咪定對(duì)于H/R損傷過程中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用，但是，影響線粒體分裂的因素有很多，同時(shí)影響鈣離子濃度的因素也很多，例如興奮性氨基酸的產(chǎn)生等。本文僅探討右美托咪定對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞H/R損傷過程中的直接影響，右美托咪定能減輕低氧復(fù)氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能是通過抑制線粒體分裂發(fā)揮作用。

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