刺絡(luò)瀉血療法對(duì)高脂血癥大鼠模型ApoCⅢ及LPL的影響

張博 趙慧玲 魏丹蕾 曾蕊 張書鵬 崔艷芝 曹范錫

摘要 目的：觀察刺絡(luò)瀉血療法對(duì)高脂血癥模型大鼠載脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）及脂蛋白酯酶（LPL）活性的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：將34只清潔級(jí)雄性SD大鼠分為空白組、模型對(duì)照組、立普妥組及刺絡(luò)瀉血組，每組8只，以高脂飼料喂養(yǎng)造模，造模持續(xù)28 d。第4周造模成功后，各造模組仍給予高脂飼料喂養(yǎng)，空白組不進(jìn)行任何干預(yù)；模型組僅抓取按壓處理，2次/周；立普妥組按照1.8 mg/（kg·d）的劑量給大鼠灌胃阿托伐他汀鈣，2次/周；刺絡(luò)瀉血組選取大鼠委中穴及足三里穴穴位附近的血絡(luò)，出血量為0.3～0.5 mL，至第8周。第9周腹主動(dòng)脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ApoCⅢ，采用光譜檢測(cè)法測(cè)定LPL、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與正常組比較，模型組ApoCⅢ、TC、LDL-C含量均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），LPL含量無(wú)明顯變化（P>0.05）；與模型組比較，刺絡(luò)瀉血組與立普妥組ApoCⅢ、TC、LDL-C含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），LPL含量無(wú)明顯變化（P>0.05）。結(jié)論：刺絡(luò)瀉血療法可以有效抑制ApoCⅢ活性，降低高脂血癥大鼠TC、LDL-C水平，還不能認(rèn)為對(duì)LPL有干預(yù)作用。

關(guān)鍵詞 高脂血癥；刺絡(luò)瀉血；載脂蛋白；脂蛋白脂肪酶

Abstract Objective：To observe the effects of pricking blood therapy on ApoCⅢ and LPL in hyperlipidemia rats and explore its mechanism. Methods：A total of 34 male SD rats were randomly divided into 4 groups：normal group， model group， lipitor group and blood pricking therapy group， with 8 in each group. Hyperlipidemia model was induced by high fat diet for 28 days. After successful modeling of 4 weeks， each group was still given high fat diet except control group. Rats in normal group didn′t accept any interventions， while the model group was treated with grabbing and pressing， twice per week. The lipitor group was given atorvastatin calciumby intragastric administration with 1.8 mg/（kg·d） each time， twice per week. In the blood pricking therapy group， the superficial vein of Weizhong and Zusanli were selected for 0.3 to 0.5 mL bleeding until the eighth week. Blood was collected from the abdominal aorta on the 9th week， and ApoCⅢ was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The levels of LPL， TC， TG， HDL-C and LDL-C were measured by spectrophotometry. Results：Comparing with the control group， the level of TC， LDL-C and ApoCⅢ of the model group were significantly increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. No significant changes were seen in LPL （P>0.05）. Compared with the model group， the level of TC， LDL-C and ApoC3 of the blood pricking therapy group and lipitor group decreased significantly， and the differences were statistically significant （P<0.05）. No significant changes were seen in LPL （P>0.05）. Conclusion：Blood-letting therapy can effectively inhibit the activity of ApoC III and reduce the levels of TC and LDL-C in hyperlipidemia rats， but it cannot be considered as an intervention to LPL.

Key Words Hyperlipidemia； Blood pricking therapy； ApoCⅢ； LPL

中圖分類號(hào)：R245.31+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.036

近年來(lái)，隨著人們生活習(xí)慣特別是飲食習(xí)慣的改變等多種因素的影響，高脂血癥的發(fā)病率有明顯増高的趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)健康人群血脂水平的調(diào)査發(fā)現(xiàn)，男女、城鄉(xiāng)人群的TG和T-CHO水平都較以往升高[1]。高脂血癥是AS和冠心?。–oronary Heart Disease，CHD）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中，LDL-C是導(dǎo)致AS的基本因素[2-3]。高脂血癥是危及人類生命和健康的主要疾病之一，是人類健康的隱形殺手，其嚴(yán)重性不容忽視。加強(qiáng)對(duì)血脂的控制可以降低CHD及其他心血管疾病發(fā)生的概率，JAMA雜志曾經(jīng)發(fā)表述評(píng)，認(rèn)為高質(zhì)量的脂質(zhì)處理和血運(yùn)重建同樣重要，降低血脂可以延緩AS的進(jìn)展[4]。有效數(shù)據(jù)證明，有效控制血脂異常，能夠降低患者的住院率化及病死率、提高存活率。高脂血癥患者主要推薦藥物治療，雖然西藥的調(diào)脂作用療效較好，但一旦停藥則療效減低甚至消失，而長(zhǎng)期應(yīng)用伴有多種不良反應(yīng)。因此尋找安全、有效、作用持久的方法治療高脂血癥，尤其探索科學(xué)合理的治療高脂血癥的臨床治療方案就顯得非常重要。本研究基于刺絡(luò)瀉血療法“祛瘀生新”理論[5]，在高脂血癥模型大鼠造模成功后，刺血足三里穴和豐隆穴對(duì)模型大鼠進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)中高脂血癥模型大鼠的載脂蛋白CⅢ（Apo CⅢ）及脂蛋白脂肪酶（LPL）的變化，分析刺絡(luò)瀉血療法對(duì)高脂血癥模型大鼠Apo CⅢ以及脂蛋白脂肪酶（LPL）的影響，研究刺絡(luò)瀉血療法治療高脂血癥的具體機(jī)制，為防治由血脂水平異常引起的心腦血管疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠34只，體重（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。在2級(jí)動(dòng)物室（北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸動(dòng)物室：室溫22 ℃，相對(duì)濕度45%）清潔條件下喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物 高脂飼料（82.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶，5%蛋黃粉和1%膽酸鈉，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供）；立普妥（阿托伐他汀鈣，10 mg/片，輝瑞制藥有限公司（國(guó)產(chǎn)），國(guó)藥準(zhǔn)字H20051407），使用前使用去離子水超聲乳化，配制成1.8 mg/mL的溶液備用。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉（Sigma試劑公司，059H0612），碘酒（上海利康消毒高科技有限公司，20140718）；大鼠載脂蛋白C-Ⅲ（ApoCⅢ）酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美提供），大鼠脂蛋白脂酶（LPL）試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，總膽固醇（T-CHO）試劑盒，三酰甘油（TG）試劑盒（南京建成提供），小號(hào)三棱針，分光光度計(jì)（UV-2100尤尼柯）恒溫水浴鍋（HW·SY11-K 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）離心機(jī)（3K18 Sigma）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀（Multiskan MK3 Thermo Scientific），自動(dòng)洗板機(jī)（DEM-3北京拓普分析儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（SKP-02.600黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）電子秤（HOCKY AD05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將34只大鼠隨機(jī)分為2組，空白組8只，模型組26只。參考Qi Zhang在Application of GC/MS-based metabonomic profiling in studying the lipid-regulating effects of Ginkgo biloba extract on diet-induced hyperlipidemia in rats中使用的造模方法對(duì)26只大鼠造模。4周后隨機(jī)選取2只造模組大鼠腹主動(dòng)脈取血，檢查血漿中總膽固醇的含量≧5.2 mmol/L[6]，提示造模成功。然后將模型組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，刺絡(luò)瀉血組及立普妥組，每組8只。

1.2.2 干預(yù)方法 全部大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白組：常規(guī)飼養(yǎng)8周，不做任何處理；模型對(duì)照組：高脂飼料喂養(yǎng)8周，從第4周后開(kāi)始，去離子水灌胃，2次/周，不做其他處理；刺絡(luò)瀉血組：高脂飼料喂養(yǎng)8周，從第4周開(kāi)始，去離子水灌胃，豐隆，足三里刺血，出血量為0.3～0.5 mL（換算公式為出血量=體重×7.4%×2%），2次/周；立普妥組：高脂飼料喂養(yǎng)8周，從第4周后開(kāi)始，按照1.8 mg/（kg·d）立普妥灌胃，2次/周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第8周末，各組大鼠禁食24 h，使用6%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈部位取血，低溫離心進(jìn)行血清分離，置-20 ℃的冰箱保存，待用于ApoCⅢ、LPL、TC、TG、HDL、LDL的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組方差齊且數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)用單因素ANOVA檢驗(yàn)，組間比較用LSD法，方差不齊或非正態(tài)時(shí)用Welch檢驗(yàn)或Nemenyi非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂4項(xiàng)的比較 實(shí)驗(yàn)8周后，各組大鼠血脂四項(xiàng)進(jìn)行比較，與空白組比較，模型對(duì)照組的總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），刺絡(luò)瀉血組和立普妥組稍有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與立普妥組比較，刺絡(luò)瀉血組總膽固醇及低密度脂蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠ApoCⅢ及LPL的比較 實(shí)驗(yàn)8周后，各組大鼠進(jìn)行比較，與空白組比較，模型對(duì)照組的ApoCⅢ含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），刺絡(luò)瀉血組和立普妥稍有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與立普妥組比較，刺絡(luò)瀉血組ApoCⅢ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各組LPL含量無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)2015年初發(fā)布的《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病調(diào)查報(bào)告》[7]顯示，2012年中國(guó)成人血脂異?；疾÷?0.40%，比較2002年的患病率水平出現(xiàn)大幅度增加，其中高膽固醇血癥患病率4.9%，高脂血癥的患病率13.1%，低高密度脂蛋白膽固醇血癥的患病率33.9%，呈現(xiàn)為國(guó)民血脂異常的普遍暴露狀態(tài)。

臨床上血脂檢測(cè)的基本項(xiàng)目為TC、TG、LDL、HDL。國(guó)內(nèi)外血脂異常防治指南均強(qiáng)調(diào)，LDL在AS的發(fā)病中起著核心作用，因此推薦LDL為首要干預(yù)靶點(diǎn)[3，8-9]，膽固醇占LDL比重的50%左右，故LDL-C濃度基本能反映血液LDL總量，那么以LDL-C作為評(píng)估一種治療方法對(duì)于高脂血癥的干預(yù)效果指標(biāo)，無(wú)疑是合適的。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)刺絡(luò)瀉血療法的確對(duì)高脂血癥有明確的治療效果，而戰(zhàn)慧敏[10]等在刺絡(luò)瀉血對(duì)高脂血癥模型大鼠血脂、NO及ET-1影響的研究中也明確了，刺絡(luò)瀉血療法對(duì)于高脂血癥模型大鼠的血脂有明確的干預(yù)作用。為探究該療法如何調(diào)控大鼠體內(nèi)的LDL，本實(shí)驗(yàn)選取了ApoC3及LPL作為研究目標(biāo)。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)刺絡(luò)瀉血療法能明顯降低ApoC3的含量，但是對(duì)于LPL無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用。

載脂蛋白CⅢ（Apolipoprotein CⅢ，Apo CⅢ）是脂蛋白代謝的重要調(diào)節(jié)蛋白之一，其主要作用是抑制具有水解血漿三酰甘油（Triglyceride，TG）功能的脂蛋白酯酶活性，并可干擾受體依賴或者非依賴途徑的肝臟對(duì)富含TG脂蛋白的攝取，并可促進(jìn)極低密度脂蛋白（Very Low Density Lipoprotein，VLDL）在肝臟的組裝和分泌。Apo CⅢ抑制富含TG的脂蛋白（TRLs）的分解和清除。無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外CM和VLDL中Apo CⅢ可以抑制肝細(xì)胞對(duì)CM和VLDL的攝取。Apo CⅢ抑制脂蛋白ApoB和肝細(xì)胞上的ApoB或ApoE受體的結(jié)合。Apo CⅢ的這種抑制作用是由于Apo CⅢ對(duì)ApoB或者ApoE的受體區(qū)域的掩蓋。Apo CⅢ也可以抑制脂蛋白酶（LPL）的活性，并且在高TG血癥的患者中，Apo CⅢ也是LPL的一個(gè)明確的抑制劑。缺乏Apo CⅢ的受試對(duì)象TRL水平較低，來(lái)自這些受試對(duì)象的血清可以激活人奶中的LPL，但是正常的血清可以有效地抑制LPL的活性。這些發(fā)現(xiàn)表明Apo CⅢ是通過(guò)抑制LPL介導(dǎo)的TRLs的脂解作用導(dǎo)致高TG血癥的發(fā)展。

ApoC3能促進(jìn)VLDL的組裝與分泌，而LDL正是從VLDL轉(zhuǎn)化而來(lái)，并且ApoC3能抑制LDL被干細(xì)胞膜上LDL受體的攝取，從而導(dǎo)致血液中LDL的升高，這正與本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)相符合。說(shuō)明刺絡(luò)瀉血療法可能是通過(guò)抑制血漿中ApoC3的含量，間接的調(diào)控血漿中LDL的含量，并且可能對(duì)LDL的含量有直接的調(diào)控作用。本次實(shí)驗(yàn)中，并未體現(xiàn)LPL的含量有明顯的變化，在與空白組比較，模型組、刺絡(luò)瀉血組、立普妥組中，LPL的含量變化基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

LPL全稱為三脂酰甘油蛋白脂?；饷福═riacylglyc-roprotein Acylhydrolase），是由LPL基因編碼的糖蛋白。1966年由Scanu在高密度脂蛋白研究中命名。成熟LPL是由448個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為55 000。LPL蛋白以單體和二聚體2種形式存在，活性形式為通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合形成的同二聚體，其催化中心由Ser132、Asp156、His241組成，LPL的酶活性必須由輔因子載脂蛋白CⅡ（apoCⅡ）激活，載脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）則抑制LPL酶活性。健康人血漿中LPL活性低，靜脈注射肝素后血漿中LPL活性明顯增加。LPL主要由脂肪細(xì)胞、心肌、骨骼肌等肝外實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成分泌，釋放入血后，借助硫酸肝素等葡糖胺聚糖結(jié)合在毛細(xì)血管內(nèi)皮上。LPL的生物作用復(fù)雜，血漿中LPL是TG代謝的限速酶，LPL的二聚體水解血液中富含TG的乳糜微粒和極低密度脂蛋白，生成的甘油、脂肪酸可供組織氧化分解并提供能量；LPL將脂蛋白結(jié)合到血管壁上，促進(jìn)TG的水解及脂蛋白顆粒的攝??；LPL還可作為L(zhǎng)DL受體的配體；LPL參與磷脂和載脂蛋白向高密度脂蛋白的轉(zhuǎn)移。LPL含量或者活性的改變可通過(guò)影響TG代謝進(jìn)而影響到高脂血癥的發(fā)病。

Heller[11]等報(bào)道阿托伐他汀未改變高脂血癥個(gè)體LPL活性，表明此藥物降低TG不是由此酶加強(qiáng)對(duì)TG飽和脂蛋白的分解作用。Kobayashi[12]等的研究結(jié)果表明，21名高脂血癥患者服用阿托伐他汀6周后，血漿LPL未見(jiàn)明顯改變。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，還不能說(shuō)明刺絡(luò)瀉血療法對(duì)LPL有調(diào)控作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較研究發(fā)現(xiàn)，與目前臨床使用他汀類降脂藥物比較，所有強(qiáng)化他汀治療的臨床研究結(jié)果均表明，數(shù)倍增量他汀確實(shí)可使AS時(shí)間發(fā)生危險(xiǎn)有所降低，但獲益的絕對(duì)值小，且全因死亡并未下降[13]，在臨床上，根據(jù)導(dǎo)師的臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用他汀類藥物的患者，雖然可以有效控制血脂中LDL的含量，但是卻有明顯的食欲減退，乏力，反酸等不良反應(yīng)，而本療法在有效降低LDL的含量的同時(shí)，不僅治療的次數(shù)少，而且并未出現(xiàn)其他的不良反應(yīng)，明顯優(yōu)于他汀類藥物，缺點(diǎn)在于本療法在治療過(guò)程中，不如他汀類藥物降低血脂迅速，如血脂過(guò)高，需要快速降低血脂指數(shù)，建議優(yōu)先選擇他汀類藥物治療，并聯(lián)合本療法，在后期治療中可以替代他汀藥物，以減輕他汀類藥物的不良反應(yīng)及停藥后的血脂升高。

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