超低溫冷凍除脂-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 檢測食用植物油中21種鄰苯二甲酸酯

馬蒙蒙,王宗義,賈明宏,王國慶,盛曄琪,翟孟婷,鄭 宇

(北京農(nóng)學(xué)院,食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)俗稱塑化劑,急性毒性弱,但具有生物積累性[1],長期食用含有塑化劑的食品,會對生殖系統(tǒng)造成一定的損傷,甚至致畸或致癌[2-4]。目前,PAEs廣泛應(yīng)用于塑料生產(chǎn)加工中,但其與塑料分子間僅由氫鍵或范德華力鏈接[5],且脂溶性較強(qiáng),故容易通過接觸遷移使食用油受到PAEs污染[6]。目前,我國尚未制定食用油中PAEs的限量,故研究高效準(zhǔn)確的PAEs檢測方法,對PAEs在食用油中殘留及遷移量的控制與監(jiān)測、維護(hù)我國食用油產(chǎn)品質(zhì)量及保障食品安全具有重要意義。

目前,PAEs主要的檢測方法有氣相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[8-11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-13]等,其中GC-MS檢測法最為常用,但其選擇性、特異性仍然不夠理想,易出現(xiàn)假陽性[14],GC-MS/MS因其更好的選擇性與靈敏度,則具有更為突出的優(yōu)勢。但就食用油而言,基質(zhì)復(fù)雜,克服以甘油脂為主體的樣品基質(zhì)干擾,仍然是PAEs檢測的關(guān)鍵。一般需要經(jīng)過選擇適當(dāng)溶劑對樣品進(jìn)行提取,再利用固相萃取法(SPE)[15-17]、凝膠滲透色譜法(GPC)[18-19]和分散固相萃取[20-21]等方法凈化完成。本研究利用超低溫冷凍除脂技術(shù)操作簡單,可有效防止樣品處理帶來PAEs污染的特點(diǎn),結(jié)合GC-MS/MS的高靈敏、高選擇性,建立了檢測食用植物油中PAEs的新方法,并對市售食用植物油進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用植物油樣品 7類19個(葵花油2個、玉米油3個、花生油4個、大豆油4個、調(diào)和油4個、菜籽油1個及橄欖油1個) 北京地區(qū)超市;鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丙酯(DIPrP)、鄰苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二異戊酯(DIPP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二正庚酯(DHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)甲醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 mg/L,1 mL) 美國o2si公司;乙腈、丙酮、正己烷 色譜純,美國J. T. Baker公司;實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水。

Agilent7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent Technologies公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;超低溫冰柜 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;MS200多管旋渦混勻儀 杭州瑞誠儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取PAEs混標(biāo)溶液用甲醇稀釋10倍,配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,標(biāo)準(zhǔn)儲備液于棕色貯液瓶中-20 ℃儲存。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL用丙酮稀釋10倍,配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液,再根據(jù)實(shí)際測定需要,用正己烷稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液,得濃度范圍為1～1000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.5 g食用植物油樣品于50 mL玻璃離心管中,加入15 mL乙腈,渦旋混和器上渦旋提取5 min,于-80 ℃超低溫冰柜中冷凍處理10 min,取出,立即于冷凍離心機(jī)中(-4 ℃)3000 r/min離心5 min使脂肪沉淀,再冷凍處理10 min,取出,并立即將上層清液倒入到雞心瓶中;另加入15 mL乙腈,重復(fù)上述步驟1次,合并兩次提取液,于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,加入正己烷1 mL復(fù)溶,全部轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中,上機(jī)檢測。試劑空白樣,除不加樣品外,其他操作相同。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始溫度為85 ℃,保持1 min;以20 ℃/min升至220 ℃,保持1 min;以5 ℃/min升至280 ℃,保持4 min。載氣(He,純度>99.999%)流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣體積1 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源,離子源溫度為230 ℃,電子能量為70 eV,溶劑延遲時間為5 min,傳輸線(MSD)溫度為280 ℃,燈絲電流為35 μA,多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測,參數(shù)見表1。

表1 21種鄰苯二甲酸酯的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of 21 PAEs

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007和MassHunter Workstation Software Quantitative Analysis B.07.01SP1分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇和處理?xiàng)l件的優(yōu)化

正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈和甲醇等溶劑均可用于提取PAEs,但就油脂樣本而言,正己烷、乙酸乙酯、丙酮與油脂互溶,宜使用乙腈和甲醇,而乙腈的效果又優(yōu)于甲醇,能更有效地減少提取液中油脂的含量[6],因此使用乙腈做為提取劑。

雖然乙腈提取液中的PAEs可直接應(yīng)用GC-MS/MS進(jìn)行有效測定,但其中溶解的脂肪容易使色譜柱柱效迅速下降,并對離子源造成污染,通常需要使用固相萃取(SPE)[15]等凈化方法,進(jìn)一步去除。但為防止PAEs的污染,SPE柱等實(shí)驗(yàn)材質(zhì)有嚴(yán)格要求[22],成本也相對較高,本實(shí)驗(yàn)采用超低溫(-80 ℃)冷凍方法進(jìn)行除脂。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),冷凍時間為5～15 min時(本實(shí)驗(yàn)為10 min),較有利于離心分離,時間過短油脂不能充分凝固,時間過長容易整體凍結(jié);離心轉(zhuǎn)速使用3000 r/min,油脂和乙腈層能夠?qū)崿F(xiàn)充分分離,轉(zhuǎn)速過高玻璃離心管容易破碎;離心后再超低溫冷凍10 min使油脂與玻璃離心管緊密凍結(jié),上層提取液可方便全部傾入雞心瓶中。由于提取和除脂過程均在同一玻璃離心管中進(jìn)行,有效避免了PAEs的污染,且操作簡單,材料成本低。

提取液的濃縮,則通常使用旋蒸結(jié)合氮吹的方法完成[23],當(dāng)提取液濃縮至1 mL左右后改用氮?dú)膺M(jìn)行吹干。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)加標(biāo)濃度低時,使用氮?dú)獯蹈珊?可明顯檢測到DMP、DBP含量顯著升高,這可能由于氮?dú)馐艿轿廴净虻獨(dú)馑芰瞎苈稰AEs釋放所致。本實(shí)驗(yàn)使用40 ℃水浴將提取液旋蒸近干,再用正己烷溶解,可有效避免氮吹過程的污染,且對PAEs檢測結(jié)果無影響。

2.2 檢出限、定量限、線性、準(zhǔn)確度和精密度

檢出限(LOD)、定量限(LOQ)在樣品和加標(biāo)樣品中目標(biāo)物定量離子對的信噪比(peak to peak)不小于3和10,且定性離子對色譜峰可識別的前提下,評估而得,21種PAEs的檢出限為0.10～8.52 μg/kg;通過對1～1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。檢出限、定量限和線性參數(shù)列于表2。

表2 21種鄰苯二甲酸酯的線性、檢出限與定量限Table 2 Linearity,LOD and LOQ of 21 PAEs

方法的準(zhǔn)確度和精密度,通過添加3個加標(biāo)水平的回收實(shí)驗(yàn)完成,每個加標(biāo)水平平行測定6次,加標(biāo)水平及結(jié)果列于表3,PAEs回收率為74.31%～116.62%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～17.82%。其中DIBP在20 μg/kg添加水平和DBEP在100 μg/kg的添加水平上的RSD相對偏高,分別為17.82%和17.14%,可能由于樣品本底的影響或操作污染所致。

表3 21種鄰苯二甲酸酯的回收率(R)及精密度(RSD)(n=6)Table 3 Recovery(R)and relative standard deviation(RSD)of 21 PAEs(n=6)

2.3 實(shí)際樣品的應(yīng)用

應(yīng)用本方法,對市售的19個食用植物油進(jìn)行了分析,DMP、DEP、DIBP、DBP、BBP、DBEP、DHP、DEHP和DNOP共9種PAEs被檢出,其中DMP、DBP、DBEP、DHP和DEHP檢出率均大于90%,結(jié)果見表4,其它12種PAEs未被檢出。結(jié)果表明,食用植物油樣品中以DMP、DBP、DBEP、DHP、DEHP 5種污染物為主,且含量較高,總量為105.57～2156.76 μg/kg。PAEs在食品中的含量與其在包裝材料中含量有關(guān)[24],結(jié)合柴超等[25]所得到的DMP、DBP和DEHP更容易由塑料包裝向食用油中進(jìn)行遷移的結(jié)論,食用植物油中PAEs污染可能由生產(chǎn)過程和包裝等塑料接觸材料遷移而來。

表4 食用植物油樣品中21種鄰苯二甲酸酯的含量(μg/kg)Table 4 The levels of 21 PAEs in edible vegetable oil samples(μg/kg)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了低溫冷凍除脂GC-MS/MS檢測食用植物油中21種PAEs含量的新方法,該方法具有樣品處理簡單,選擇性好、靈敏度高,定性、定量可靠等特點(diǎn),可滿足監(jiān)測相關(guān)食用植物油中PAEs的需要,對市售食用植物油分析顯示,PAEs污染主要以DMP、DBP、DBEP、DHP、DEHP為主。