嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的檢測(cè)

尹麗麗,薛 霞,周禹君,鄭 紅,王 駿,祝建華,劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東濟(jì)南 250101)

維生素K1又名葉綠基甲萘醌,是促進(jìn)血液正常凝固及骨骼生長(zhǎng)的重要維生素。維生素K是肝內(nèi)合成凝血酶原的必需物質(zhì),維生素K缺乏時(shí),可導(dǎo)致凝血機(jī)制障礙[1]。經(jīng)常流鼻血者、近期有嚴(yán)重灼傷或外傷者、正服用抗生素者和早產(chǎn)嬰兒等都容易發(fā)生維生素K缺乏癥。在臨床上,已將維生素K1用于獲得性維生素K依賴性凝血因子缺乏癥[2]、新生兒自然出血癥[3-4]等維生素K缺乏癥的防治。研究表明,在嬰幼兒配方乳粉中添加一定量的維生素K1,對(duì)于維生素K缺乏癥有很好的預(yù)防作用。

維生素K1是一種脂溶性維生素,屬于多環(huán)芳香酮,對(duì)熱、氧、及水分作用穩(wěn)定,但在堿性環(huán)境下,受陽(yáng)光照射會(huì)分解。

對(duì)于維生素K1的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[5],分光光度法[6],液相色譜-紫外檢測(cè)器法[7-11],液相色譜-柱后衍生法[12-14]。其中毛細(xì)管電泳法和分光光度法檢測(cè)步驟繁瑣,且精密度不高;高效液相色譜紫外檢測(cè)器法的靈敏度低;而文獻(xiàn)[12-14]中使用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測(cè)器時(shí),由于流動(dòng)相中使用的二氯甲烷對(duì)反相色譜系統(tǒng)的脫氣包具有強(qiáng)烈的腐蝕作用,對(duì)儀器損害較大;此外,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]中使用的四氫呋喃對(duì)人體危害較大。目前,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]中,嬰幼兒配方乳粉中維生素K1檢測(cè)的前處理過(guò)程是:用脂肪酶酶解,經(jīng)堿皂化后,用有機(jī)溶劑提取。在此過(guò)程中,由于維生素K1在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定等原因,往往會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物回收率低,檢測(cè)結(jié)果精密度差。

本文采用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測(cè)法對(duì)嬰幼兒配方乳粉中維生素K1的檢測(cè)進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相條件,減少了對(duì)反相色譜系統(tǒng)的儀器損害,提高了方法的靈敏度和選擇性;針對(duì)方法中的關(guān)鍵步驟-酶解、皂化和萃取進(jìn)行了分析、總結(jié)和優(yōu)化,使維生素K1的檢測(cè)方法更加穩(wěn)定可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品 Dr.Ehrenstorfer公司;脂肪酶(酶活力≥700 U/mg) sigma公司;甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher公司;symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)Waters公司;鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;正己烷(色譜純) 美國(guó)默克公司;酚酞(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鈉(分析純) 西隴化工股份有限公司;碳酸鉀(優(yōu)級(jí)純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氯化鋅(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸鈉(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;嬰幼兒配方乳粉 超市購(gòu)買某知名品牌。

Waters 2695高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司;AB204-S型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;SB-800DTD型超聲波清洗器 中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司;3-18K型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;mini-Q超純水制備器 美國(guó)MILLIPORE公司;HGC-24型氮吹儀 中國(guó)HENGAO公司;恒溫水浴振蕩器 德國(guó)優(yōu)博萊公司;渦旋混合器 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的校正 稱取維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg于10.00 mL容量瓶中,用正己烷溶解并定容,配制成維生素K1母液。取200 μL維生素K1母液至25 mL容量瓶中,用正己烷定容,配制成濃度約為16 μg/mL的校正溶液,用紫外可見分光光度計(jì)在248 nm條件下校正(校正方法見[15])。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 精確移取經(jīng)校正過(guò)的維生素K1儲(chǔ)備液,氮?dú)獯蹈珊?用甲醇溶解,配制成濃度為:0.2,0.5,1,2,5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品處理過(guò)程 準(zhǔn)確稱取乳粉試樣2.5 g(精確到0.01 g),于50 mL離心管中,加入一定量的脂肪酶后,加入10 mL(37±2) ℃溫水溶解,渦旋2～3 min后,置于(37±2) ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩一定時(shí)間,使其充分酶解。取出酶解好的試樣,加入10 mL無(wú)水乙醇,加入一定量的堿,充分混合均勻,進(jìn)行皂化反應(yīng)。加入15 mL正己烷,渦旋5 min,進(jìn)行萃取。5000 r/min離心3 min,取上清液至50 mL離心管,加入10 mL飽和氯化鈉溶液和兩滴0.5%酚酞乙醇溶液,渦旋5 min,進(jìn)行水洗。6000 r/min離心3 min,取上清液至50 mL離心管中,氮?dú)獯蹈?準(zhǔn)確加入2.00 mL甲醇復(fù)溶,過(guò)有機(jī)濾膜后,高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 高效液相色譜條件 symmetry C18色譜柱:250 mm×4.6 mm,5 μm;鋅還原柱:50 mm×4.6 mm;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)為243 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:甲醇(含有冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無(wú)水乙酸鈉0.5 g/L)。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性范圍與檢出限 將1.2.1.2配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行液相色譜條件下測(cè)定,以維生素K1峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。加標(biāo)空白樣品基質(zhì)按照1.2.2樣品前處理過(guò)程,在1.2.3液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)目標(biāo)物的響應(yīng)與背景噪音的比值計(jì)算維生素K1的方法檢出限。

1.2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)32、72、115μg/100 g三個(gè)不同含量的樣品分別進(jìn)行6次獨(dú)立測(cè)定,計(jì)算精密度。

1.2.4.3 回收率實(shí)驗(yàn) 根據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》的要求,結(jié)合實(shí)際檢測(cè)樣品中維生素K1的含量,對(duì)空白樣品進(jìn)行5、10、100 μg/100 g三個(gè)水平的加標(biāo)測(cè)定,計(jì)算加標(biāo)樣品測(cè)定值與樣品測(cè)定值之差,通過(guò)其差值與實(shí)際添加的目標(biāo)物含量之間的比值計(jì)算回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的Empower 3工作站軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理。

2 結(jié)果與分析

本文對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]中的關(guān)鍵技術(shù)-酶解條件、皂化條件和萃取條件和流動(dòng)相條件進(jìn)行研究,經(jīng)過(guò)優(yōu)化并改進(jìn),維生素K1的檢測(cè)方法更加穩(wěn)定、可靠。

2.1 酶解條件的選擇

前處理過(guò)程中,首先用脂肪酶降解試樣中的不飽和脂肪酸,在酶解過(guò)程中,酶的用量對(duì)目標(biāo)物的提取有一定影響,本文比較了酶解時(shí)間和脂肪酶用量不同時(shí),目標(biāo)物的回收率與精密度。由表1可知,酶解6 h和12 h(脂肪酶量為0.8 g條件下),對(duì)于目標(biāo)物含量的測(cè)定,效果相當(dāng),但是由于前處理操作復(fù)雜,包括酶解、皂化、萃取、水洗等步驟,如果樣品量少,可選擇當(dāng)天酶解6 h,如果樣品量多,當(dāng)天酶解時(shí)間緊迫,建議選擇酶解過(guò)夜12 h;另一方面,不同脂肪酶量在酶解12 h的條件下,回收率無(wú)明顯差異,但是酶量越小(即0.2 g和0.4 g酶量)時(shí),后續(xù)的萃取步驟中液液兩相分層越不明顯,結(jié)果的精密度越差,當(dāng)酶量較大(即0.8 g脂肪酶),后續(xù)的萃取步驟中液液兩相分層明顯,結(jié)果精密度好,故采用0.8 g脂肪酶酶解12 h的酶解條件。

表1 酶解條件的比較Table 1 Comparison of enzyme solution conditions

2.2 皂化條件的選擇

皂化反應(yīng)中,堿的作用是使酶解后的脂肪生成脂肪酸鹽,溶解于水相中,加入量的多少會(huì)直接影響回收率。加入量過(guò)少會(huì)使皂化反應(yīng)不完全,萃取時(shí)不容易分層;過(guò)多則會(huì)和目標(biāo)物維生素K1反應(yīng),使最后的結(jié)果偏低;乙醇的作用是保護(hù)維生素K1不參與反應(yīng),同時(shí)起到消泡促進(jìn)分層的作用。本文對(duì)皂化條件中堿的種類及用量進(jìn)行了考察,具體結(jié)果見表2。由表2可知,皂化用堿若選擇NaOH溶液(10 moL/L,2 mL)回收率低,精密度差,若選擇NaOH溶液(10 moL/L,0.5 mL)時(shí),精密度差。原因可能是由于兩種NaOH溶液堿性太高,目標(biāo)物與堿反應(yīng)而被分解,故在此條件下不穩(wěn)定存在;本文在皂化反應(yīng)中使用K2CO3固體,堿性相對(duì)低,目標(biāo)物在此條件下穩(wěn)定存在,因此具有較高的回收率和精密度。

表2 皂化條件的比較Table 2 Comparison of saponification conditions

2.3 萃取條件和水洗條件的比較

萃取是為把目標(biāo)物維生素K1從皂化后溶液中萃取出來(lái),也是進(jìn)一步凈化的過(guò)程。維生素K1是脂溶性維生素,故采用有機(jī)溶劑正己烷作為萃取溶劑。文章對(duì)于萃取次數(shù)進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)萃取兩次和萃取一次的測(cè)定結(jié)果基本一致,因此,從提高前處理效率的角度,建議萃取一次。

由于維生素K1對(duì)堿液不穩(wěn)定,所以需要用水把萃取溶劑正己烷中可能攜帶的堿液洗掉。另外,水洗時(shí)加入飽和氯化鈉,可防止液液分配過(guò)程的乳化。從表3中可以看出,增加水洗步驟,可明顯提高目標(biāo)物含量隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性,但是水洗2次,目標(biāo)物含量損失變大,因此,建議水洗一次。

表3 水洗對(duì)目標(biāo)物含量穩(wěn)定性考察Table 3 The stability of target content by washing

為了使有機(jī)相和水相分層明顯,保證實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性,水洗過(guò)程中需加入兩滴酚酞溶液(0.5%)。加入酚酞是否影響目標(biāo)物含量的測(cè)定結(jié)果見表4。從表4中可以看出,加入酚酞不影響對(duì)目標(biāo)物含量的測(cè)定。

表4 酚酞對(duì)目標(biāo)物的影響Table 4 The effect of phenolphthalein on target objects

2.4 流動(dòng)相條件的比較

目前,高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測(cè)的檢測(cè)方法中通常流動(dòng)相含有四氫呋喃或二氯甲烷。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]中流動(dòng)相使用的四氫呋喃,四氫呋喃對(duì)身體危害較大;文獻(xiàn)中[12-14]使用的流動(dòng)相含有二氯甲烷,二氯甲烷對(duì)反相色譜系統(tǒng)的脫氣包具有強(qiáng)烈的腐蝕性,長(zhǎng)期大量使用會(huì)造成脫氣包滲漏。本文比較了流動(dòng)相中是否含有二氯甲烷對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響,具體譜圖見圖1～圖4。圖1和圖2為使用流動(dòng)相A(甲醇中含有冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無(wú)水乙酸鈉0.5 g/L)條件下采集的色譜圖。圖3和圖4為使用流動(dòng)相B(甲醇中含有二氯甲烷10%,冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無(wú)水乙酸鈉0.5 g/L)條件下采集的色譜圖。通過(guò)比較圖2和圖4發(fā)現(xiàn),使用流動(dòng)相A(不含二氯甲烷溶液)進(jìn)行色譜分析,峰型理想,分離效果相對(duì)更好。流動(dòng)相中不含有二氯甲烷,減少了對(duì)儀器反相系統(tǒng)的損害,也減少了對(duì)身體的危害,故本文使用流動(dòng)相條件A。

圖1 使用流動(dòng)相A條件下采集的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard solution by using phase A

圖2 使用流動(dòng)相A條件下采集的樣品的色譜圖Fig.2 The chromatogram of samples by using phase A

圖3 使用流動(dòng)相B條件下采集的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard solution by using phase B

圖4 使用流動(dòng)相B條件下采集的樣品的色譜圖Fig.4 The chromatogram of samples by using phase B

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍與檢出限 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性回歸方程為:Y=2.1E+6X-69808,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。本文采用加標(biāo)空白樣品基質(zhì)中標(biāo)樣對(duì)應(yīng)的響應(yīng)與背景噪音的比值(S/N=3計(jì)算得到維生素 K1的方法檢出限為1 μg/100 g。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 由表5可見,三個(gè)樣品的精密度均小于5%,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定,精密度較高。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision experiment

2.5.3 回收率實(shí)驗(yàn) 由表6可知,空白樣品進(jìn)行三個(gè)水平的加標(biāo)測(cè)定,回收率在90%～110%之間。本方法對(duì)乳粉質(zhì)控樣品NIST SRM 1849a樣品進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定結(jié)果為0.97 mg/kg,在標(biāo)定值(1.06±0.17 mg/kg)的偏差范圍內(nèi)。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery

3 結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)表明,影響乳粉中維生素K1測(cè)定的關(guān)鍵因素有:酶解條件、皂化條件、萃取條件和流動(dòng)相條件。本文通過(guò)對(duì)關(guān)鍵因素的考察,確定了以下實(shí)驗(yàn)條件,包括酶解條件:酶解量0.8 g,酶解時(shí)間12 h;皂化條件:碳酸鉀1.0 g;萃取條件:正己烷萃取一次,飽和氯化鈉水洗一次;流動(dòng)相條件:甲醇(含有冰乙酸0.03%,氯化鋅1.5 g/L,無(wú)水乙酸鈉0.5 g/L)。

綜上所述,本文通過(guò)對(duì)方法中關(guān)鍵技術(shù)條件的優(yōu)化,使維生素K1的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確度高,同時(shí)減少了對(duì)液相色譜儀-反相系統(tǒng)的損傷,降低了對(duì)檢驗(yàn)人員身體的危害。本方法不僅可以為生產(chǎn)企業(yè)控制維生素K1的添加量、準(zhǔn)確標(biāo)示給予指導(dǎo),還可以為科研機(jī)構(gòu)積累、總結(jié)維生素K1含量范圍及趨勢(shì)提供技術(shù)支持。