野菊莖葉多糖的 提取工藝優(yōu)化及其性質研究

劉存芳,杜全超,史 娟,張 強,田光輝

(陜西理工大學陜西省催化基礎與應用重點實驗室,陜西漢中 723000)

野菊(ChrysanthemumindicumL.)又俗稱苦薏、野黃菊、瘧疾草等,是菊科菊屬的一種多年生草本植物,全國各地分布廣泛,資源豐富,常生長于山坡草地、田邊路旁,喜涼爽濕潤的環(huán)境,耐寒,陜西秦巴山區(qū)盛產(chǎn)野菊。野菊花是野菊的頭狀花序[1],作為中藥材廣泛使用[2-3],野菊花中的活性成分研究較多[4],其含有黃酮[5]、揮發(fā)油和萜類[6-7]、多糖[8]、蛋白質和氨基酸、維生素以及營養(yǎng)元素等物質[9-10],能清熱解毒、消腫,治療咽喉腫痛、癰疽、丹毒、疔瘡、濕疹[11],抑制病毒、保肝護肝[12],其中野菊花多糖還能清除氧自由基,有抗衰老、增強機體抵抗力等功效[13-14],野菊花藥理活性的研究也較多[15-16]。

野菊莖葉中同樣含有豐富的活性成分[17-18],如有機酸、黃酮、多糖和糖苷、萜類、揮發(fā)油、苯丙素類以及營養(yǎng)元素等[19-21],其莖葉的開發(fā)應用研究還尚少[22-23],在野菊花作為中藥材的收集過程中有大量的野菊莖葉產(chǎn)生,野菊莖葉沒能得到充分利用,其有開發(fā)應用的價值[24]。另外,目前關于野菊多糖的研究幾乎沒有,本文用超聲波輔助熱水浸提法提取野菊莖葉中的多糖,在單因素實驗的基礎上設計正交實驗來優(yōu)化其多糖的最佳提取工藝,并對其多糖中的單糖組成進行分析,初步測試其多糖的抗氧化活性,為野菊莖葉的綜合利用可提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野菊的莖葉 由陜西理工大學植物學分類專家趙樺教授鑒定,確定是野菊(ChrysanthemumindicumL.)的莖葉。葡萄糖(Glu)、果糖(Fru)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha) 均為分析純,美國Sigma公司;維生素C(VC)、無水乙醇、95%乙醇、無水乙醚、濃硫酸、苯酚、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、苯、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐 均為國產(chǎn)分析純;水 二次蒸餾水;0.75 mmol的鄰二氮菲溶液、PBS溶液為150 mmol/L的pH7.4的磷酸緩沖溶液、0.75 mmol的硫酸亞鐵溶液、0.01%的過氧化氫溶液,臨時配制。

Finnigan-TraceDSQ型GC-MS儀 美國熱電公司;UV-2102 PCS 型紫外-可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;SB-4200DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;METTLERAE240分析天平 上海托利多-梅特勒儀器有限公司;索氏提取器、布氏漏斗、抽濾瓶等器皿 天津市世博偉業(yè)化玻儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野菊莖葉的預處理及野菊莖葉多糖粗提液的制備 將收集好的野菊莖葉除去雜葉,在50 ℃恒溫下干燥至恒重,用中草藥粉碎機打碎成粉末,過200目篩,密封保存?zhèn)溆?。稱取0.2 g野菊莖葉粉末裝入索氏提取器中,以乙醚為溶劑回流脫色脫脂[25-26],至提取液呈無色,再換用95%乙醇回流,目的是脫去野菊莖葉中的極性小分子如黃酮、萜類、游離態(tài)單糖以及其他醇溶性物質,回流至提取液呈無色后將野菊莖葉粉末取出晾干,回收乙醚和乙醇。晾干的野菊莖葉粉末置于塑料提取管內(nèi)加適量水,在超聲波清洗機內(nèi)提取多糖,在不同的料液比、提取溫度、提取時間、超聲功率等條件下提取野菊莖葉中的多糖。抽濾,重復浸提一次,合并濾液,得野菊葉多糖的粗提液。

1.2.2 野菊莖葉多糖提取量的確定 用苯酚-硫酸法測定多糖含量[25]。

1.2.2.1 標準曲線的制作 準確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10.00 mg定容于10 mL容量瓶中,配成1 mg/mL的對照品溶液,取8支10 mL的具塞比色管,準確吸取對照品溶液,用水補足2 mL,分別稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL的8個不同濃度的系列溶液,再分別加入6%苯酚溶液3 mL混勻,加入濃硫酸5 mL,迅速搖勻,放入80 ℃恒溫水浴中,加熱20 min后取出,冷卻至室溫,以水作空白參比,在490 nm波長處用分光光度計測定吸光度值。以吸光度(y)值作縱坐標,以質量濃度(x)值作橫坐標可得回歸方程為:y=15.038x+0.0652,R2=0.9983,在0.02～0.16 mg/mL的濃度范圍內(nèi),質量濃度與吸光度呈良好的線性關系。

1.2.2.2 多糖提取量的測定 將野菊葉多糖的粗提液轉移至150 mL容量瓶中,潤洗,定容,然后準確量取2 mL溶液于具塞比色管中,緩慢加入3 mL 6%苯酚和5 mL98%濃硫酸,迅速搖勻,在80 ℃恒溫水浴中,加熱20 min后取出,冷卻至室溫,在490 nm波長下,測量吸光度,結合標準曲線,通過式子,提取量(g/100 g)=多糖質量/原料質量×100確定野菊莖葉多糖的提取量,以質量百分含量表示。

1.2.3 野菊莖葉多糖提取工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 在超聲溫度80 ℃,超聲時間35 min,超聲功率360 W時,考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 (g/mL);在料液比1∶50 (g/mL),超聲時間35 min,超聲功率360 W時,超聲溫度為50、60、70、80、90、100 ℃(溫度過高時,水浴中通入水蒸氣控溫);在料液比1∶50 (g/mL),超聲溫度80 ℃,超聲功率360 W時,超聲時間為15、20、25、30、35、40 min;在料液比1∶50 (g/mL),超聲溫度80 ℃,超聲時間35 min時,超聲功率為300、320、340、360、380、400 W等單因素條件下對野菊莖葉多糖提取的影響。

1.2.3.2 正交實驗 在單因素實驗基礎上,以料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率為因素,每個因素取3個水平,設計L9(34)正交實驗優(yōu)化野菊莖葉多糖的提取條件如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表L9(34)Table 1 The factor-levelTable of orthogonal tests L9(34)

1.2.4 野菊莖葉多糖的精制 稱取野菊莖葉粉末100 g在索氏提取器中,分別用乙醚和95%乙醇回流至提取液呈無色,回收乙醚和乙醇。取出粉末晾干,在最佳提取工藝條件下提取多糖,抽濾;將粉末用水重新提取一次抽濾,合并兩次的提取液。減壓蒸餾提取液為四分之一體積時轉移到燒杯中,加入5倍體積無水乙醇沉淀,靜置24 h,抽濾,濾餅在105 ℃下干燥,得粗多糖。重復提取粗多糖5次,合并粗多糖,用水溶醇沉法純化多糖,通過Sevag法脫蛋白(氯仿∶正丁醇=4∶1),在DEAE-纖維素柱(5.0 cm×120 cm)用水洗脫,用苯酚-硫酸顯色收集洗脫液,減壓濃縮收集液,用無水乙醇沉淀過夜,抽濾、在105 ℃下干燥,得野菊莖葉精制多糖。

1.2.5 野菊莖葉多糖的單糖組成分析 稱取野菊莖葉精制多糖12 mg 于安瓿瓶中滴加水全部溶解后,加入4 mL 5 mol/L的三氟乙酸溶液后真空密封,在110 ℃的溫度下水解2.5 h,水解液冷卻,減壓蒸餾直至無明顯水分,再加入2.5 mL苯,減壓蒸餾回收苯,再加苯2次重復以充分除去三氟乙酸和水,得到野菊莖葉多糖的水解物,減壓干燥。糖腈乙酸酯衍生化后用GC-MS分析野菊莖葉多糖的單糖組成,取野菊莖葉多糖的水解物加入20 mg鹽酸羥胺,用3 mL吡啶溶解,密封后在90 ℃下水浴35 min,冷卻后,滴加1.1 mL乙酸酐,再次密封于90 ℃下水浴35 min后,在60 ℃水浴中敞口用氮氣吹干,得到野菊莖葉多糖水解物的糖腈乙酸酯衍生物,用2 mL氯仿溶解,直接吸取在GC-MS儀中分析,對照品單糖的混合樣品,按照該方法衍生化后再進行分析。對照品單糖進行定性,色譜峰面積歸一化法定量來確定野菊莖葉多糖中各單糖的比例。GC-MS儀工作為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱,氣相色譜條件:載氣為He氣,柱溫:50～250 ℃;初始溫度為50 ℃,保持1 min,以10 ℃/min程序升溫200 ℃,保持1 min,再以5 ℃/min升溫250 ℃,進樣口溫度為250 ℃;衡流模式流量為1 mL/min,進樣量為0.5 μL,分流比為25∶1,色質界面溫度為250 ℃。質譜條件:EI離子源,電離能量70 eV,離子源溫度250 ℃,倍增器電壓976 V,掃描范圍80～550質量單位,全掃描模式。

1.2.6 野菊莖葉多糖對羥基自由基的清除率測定 可測定野菊莖葉多糖在Fenton體系中對Fe2+/H2O2產(chǎn)生的羥基自由基清除率[26]。稱取5 mg 野菊莖葉精制多糖在50 mL的容量瓶中配置成濃度為0.1 mg/mL的溶液,取8支10 mL的具塞比色管,其中6支編號為1～6號,分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL多糖溶液;另2支標記為未損傷管和損傷管,不加多糖溶液。分別向8支比色管中加入1 mL鄰二氮菲溶液、1.5 mL PBS 溶液和1 mL FeSO4溶液,搖勻,再向1～6號以及損傷管中加入1 mL 0.01%的H2O2溶液,用水將8支比色管定容至刻度線并充分搖勻,在37 ℃下普通培養(yǎng)箱中保溫2 h后取出冷卻至室溫,在510 nm下測量樣品吸光度I。實驗重復三次,取平均值。同時,以相同濃度的VC作為對照。自由基清除率(%)=(In-I0)/(I1-I0)×100,式中:In為加多糖或VC溶液的吸光度,I1為未損傷溶液的吸光度;I0為損傷溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用OriginLab Origin V 8.0軟件處理數(shù)據(jù)和繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 影響野菊莖葉多糖提取的單因素

2.1.1 料液比對野菊莖葉多糖提取的影響 料液比對野菊莖葉多糖提取量的影響如圖1,在料液比變化1∶20～1∶50 (g/mL)之間,隨著料液比的減小野菊莖葉多糖的提取量逐漸增大,當料液比超過1∶50 (g/mL)后,野菊莖葉多糖的提取量逐漸降低。當料液比較大時,溶劑較少,多糖擴散阻力較大,多糖的溶解量較少,溶出率也就比較小;隨著料液比的減小,野菊莖葉多糖溶出率隨著溶劑量增加,當料液比過小時,溶劑量過多,吸收損耗了部分超聲波,會導致多糖對超聲波能量的不敏感,難以從細胞壁上或細胞中脫離,溶出率相對減小,另外,溶劑過多時不利于后續(xù)的多糖處理。因此后續(xù)選取料液比為1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)三個水平進行正交實驗。

圖1 料液比對多糖提取量的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on the extraction of polysaccharides

2.1.2 超聲溫度對野菊莖葉多糖提取的影響 超聲溫度對野菊莖葉多糖提取結果如圖2所示,提取溫度在50～80 ℃時,野菊莖葉多糖提取量隨著溫度的升高而升高,在80 ℃時多糖提取量最高,可高達6.01 g/100 g。當超過了80 ℃后,野菊莖葉多糖提取量逐漸下降,隨著溫度的升高在超聲作用下會使野菊莖葉多糖發(fā)生分解。因此后續(xù)選取超聲溫度為70、80、90 ℃。

圖2 溫度對多糖提取量的影響Fig.2 The effect of temperature on the extraction of polysaccharides

2.1.3 超聲時間對野菊莖葉多糖提取的影響 超聲時間對野菊莖葉多糖提取的影響結果如圖3所示,可看出在15～30 min時野菊莖葉多糖提取量隨著時間的延長而遞增,在30 min時多糖提取量可高達5.82 g/100 g,多糖提取量在30 min后開始下降。30 min之前野菊莖葉多糖隨時間溶出程度增大,30 min后,過長時間的超聲波會使部分多糖鏈斷裂造成損失影響野菊莖葉多糖的提取量。因此后續(xù)選取超聲時間為25、30、35 min三個水平。

圖3 時間對多糖提取量的影響Fig.3 The effect of time on the extraction of polysaccharides

2.1.4 超聲功率對野菊莖葉中多糖提取的影響 超聲功率對野菊莖葉多糖提取的影響如圖4,超聲功率在300～340 W之間時野菊莖葉多糖的提取量逐漸升高。當超聲功率為340 W時

圖4 功率對多糖提取量的影響Fig.4 The effect of power on the extraction of polysaccharides

野菊莖葉多糖提取量達到最高,超聲功率超過340 W之后多糖提取量下降。超聲波的空化效應能產(chǎn)生劇烈的震動,會破壞植物細胞結構減少溶劑進入植物細胞組織的阻力,加速多糖的溶出。超聲功率較小時,空化效應的作用較小,多糖溶入溶劑中的速率也會小,多糖提取量相對較低,隨著超聲功率的增加,超聲波的空化作用增強,野菊莖葉的細胞組織易破損,加快了多糖分子溶入溶劑中的速率,提高了多糖溶出量。超聲波作用于細胞時也會產(chǎn)生局部的升溫,當超聲波功率過大時,局部溶液升溫過熱會破壞多糖的結構,影響多糖的提取量,超聲波的功率不宜太大。因此后續(xù)選取超聲功率為320、340、360 W三個水平。

2.2 正交實驗優(yōu)化野菊莖葉多糖的提取工藝

以野菊莖葉多糖的提取量作為考察指標,經(jīng)過極差和均值分析來確定超聲波輔助熱浸提取野菊莖葉多糖的最佳工藝。由表2可知,影響野菊莖葉多糖提取的各因素主次關系為:超聲溫度>料液比>超聲功率>超聲時間,最佳提取工藝為超聲溫度80 ℃,料液比1∶40 (g/mL),超聲波時間35 min,超聲波功率360 W。

表2 正交實驗結果Table 2 the results of orthogonal tests

經(jīng)過3次平行驗證實驗,在最優(yōu)條件下提取野菊莖葉多糖,提取量可高達6.26 g/100 g。提取中溫度相對不高,提取時間相對較短,料液比值偏小可減小提取中溶劑蒸發(fā)的影響,可用于中小企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 野菊莖葉多糖的單糖組成

對照品單糖混合樣品的糖腈乙酸酯衍生物經(jīng)GC-MS分析的總離子流圖如圖5所示,在色譜條件下能完全分離,果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的色譜峰沒有重疊。野菊莖葉多糖水解物的糖腈乙酸酯衍生物經(jīng)GC-MS分析的總離子流圖如圖6所示,結合圖5中各對照品單糖的色譜峰出峰時間,可以確定出野菊莖葉多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等6種單糖組成,沒有檢出果糖。色譜峰面積歸一化法確定出野菊莖葉多糖中的半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖6種單糖按照色譜峰面積34.58∶27.61∶19.32∶10.53∶4.11∶3.85的比例組成,說明野菊莖葉多糖是雜多糖,以半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖為主,占總面積的81.51%。

圖5 混合對照品單糖糖腈乙酸酯 衍生物的GC-MS總離子流圖Fig.5 TIC chromatogram of standard monosaccharides by nitrile acetic ester derivative

圖6 野菊莖葉多糖水解物的糖腈乙酸酯 衍生物的GC-MS總離子流圖Fig.6 TIC chromatogram of polysaccharide hydrolysate by nitrile acetic ester derivative from the branches and leaves of Chrysanthemum indicum

2.4 野菊莖葉多糖對羥基自由基有清除作用

由圖7可得,野菊莖葉多糖對Fe2+/H2O2產(chǎn)生的羥基自由基有明顯地清除作用,其多糖濃度和清除效果存在著一定的量效關系,隨著野菊莖葉多糖濃度的增加對羥基自由基的清除率不斷增強。和VC對羥基自由基的清除率相比偏低,但也表現(xiàn)出明顯地清除作用,說明野菊莖葉多糖有抗氧化活性,是一種潛在的天然抗氧化物質。

圖7 野菊莖葉多糖對羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of polysaccharide from the branches and leaves of Chrysanthemum indicum on hydroxyl radical

3 結論

野菊莖葉粉末脫色脫脂之后,在考察料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率等單因素影響多糖提取量的基礎上,設計正交實驗確定野菊莖葉多糖最佳提取工藝為超聲溫度80 ℃,料液比1∶40 (g/mL),超聲時間35 min,超聲功率360 W,該條件下多糖的提取量為6.26 g/100 g,這可為利用超聲波輔助熱水浸提法提取野菊莖葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術支撐,也為分步提取野菊莖葉中的活性物質,充分利用天然資源提供參考。

在最優(yōu)提取工藝條件下對所得多糖進行精制,用色譜峰面積歸一化法確定精制野菊莖葉多糖中單糖的比例,野菊莖葉多糖是由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖6種單糖按照色譜峰面積34.58∶27.61∶19.32∶10.53∶4.11∶3.85的比例組成,說明該野菊莖葉多糖是以半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖為主的雜多糖。通過Fenton體系以VC為對照來確定野菊莖葉多糖對羥基自由基的清除作用,與VC相比對羥基自由基的清除率較低,但也表現(xiàn)出明顯地清除作用,說明野菊莖葉多糖有抗氧化活性,野菊莖葉多糖的其他抗氧化效果以及其他生物活性還有待進一步研究。