雙孢菇菇柄多糖柱層析純化及單糖組成

李順峰,王安建,田廣瑞,劉麗娜,魏書信

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002)

近年來,關(guān)于食用菌及食用菌多糖提取物調(diào)控人體免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤細(xì)胞生長、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗疲勞等相繼被報(bào)道,而這些功能均與其含有的多糖類物質(zhì)相關(guān)[1-7]。從多糖的組成和結(jié)構(gòu)來看,多糖本身或者多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合都表現(xiàn)出一定的生理活性,而不同的單糖成分、主鏈糖苷鍵連接方式、支鏈的分枝數(shù)目以及多糖的空間構(gòu)象,也會對其藥理作用產(chǎn)生一定的影響[3]。因此,多糖的生理活性功能與其單糖組成和單糖連接方式密切相關(guān)。Scarpari等[3]也指出,在目前的有關(guān)食用菌中β-葡聚糖的純化方法來看,如果采取的方法不合適,會阻礙結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化,致使其生物學(xué)特性給人造成困惑或矛盾。因此,采用正確合理的技術(shù)對粗多糖進(jìn)行純化,并解析多糖的理化性質(zhì)、分子量、聚合度、單糖組成和主鏈糖苷鍵連接方式等,可有助于分析多糖與其藥理作用的關(guān)系。

雙孢菇,又稱白色紐扣蘑菇,是全球栽培面積和消費(fèi)量最大的食用菌之一。目前,已有研究者針對雙孢菇子實(shí)體多糖進(jìn)行了提取和生物活性評價(jià)[8-12],其中,雙孢菇含有的線性(1→6)β-D-葡聚糖具有促進(jìn)控制炎癥基因表達(dá)的功能,從而降低炎癥的發(fā)生[13];雙孢菇菌種深層培養(yǎng)基提取的胞外多糖具有抗氧化和清除自由基的能力[14];同時(shí),雙孢菇粗多糖純化物可以降低惡性腫瘤細(xì)胞(Sarcoma 180)的生長[15];而且Ruthes等[16]也首次指出雙孢菇含有的海藻半乳糖具有顯著抗敗血、鎮(zhèn)痛和抗發(fā)炎的功效;Smiderle等[17]比較了雙孢菇(Agaricusbisporus)和巴西蘑菇(Agaricusbrasiliensis)的多糖提取物在結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)功能上的差異,結(jié)果表明,雙孢菇多糖中甘露半乳糖(mannogalactan)含量較高,巴西蘑菇中β-葡聚糖含量較高,而且兩種不同蘑菇多糖的單糖組分和比例也各不相同。此外,兩種多糖雖然都可刺激促炎癥因子的細(xì)胞因子和酶的產(chǎn)生,但是巴西蘑菇多糖還能降低促炎細(xì)胞的合成,表明它是一種程序化的免疫調(diào)節(jié)多糖。然而,這些研究并未指明采用的雙孢菇材料是否包含菇柄,對于約占雙孢菇子實(shí)體重量約20%～30%的菇柄而言,生產(chǎn)過程中大多被作為廢棄物處理。本研究采用雙孢菇菇柄為試材,對菇柄多糖進(jìn)行柱層析分離純化及純度鑒定,并對柱層析得到的多糖組分進(jìn)行紅外光譜分析和單糖組成分析,為雙孢菇菇柄多糖的利用和附加值提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇菇柄 洛陽奧達(dá)特食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司;葡萄糖、濃硫酸、重蒸酚、無水乙醇、溴化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 均為國產(chǎn)分析純;中性蛋白酶(食品級,10萬U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;透析袋MD55(截留分子量:3500 Da) 北京索萊寶科技有限公司。

FA2004C型分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;HN-1000Y型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海汗諾儀器有限公司;H2050R型臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;RV8V-C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA集團(tuán);UV1800型紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;LD-Y300A型高速萬能粉碎機(jī) 上海頂帥電器有限公司;Lyovac GT1型冷凍干燥機(jī) 德國SRK系統(tǒng)技術(shù)公司;Nicolet is5型傅立葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司;ICS-5000型離子色譜儀 美國黛安公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖樣品制備 在參考大量文獻(xiàn)資料[4,6,9-10,14,18-21]及前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,綜合考慮各方面的因素,確定雙孢菇菇柄多糖制備工藝流程為:

雙孢菇菇柄用高速粉碎機(jī)粉碎(12000 r/min,3 min),過40目篩→80 ℃下用85%乙醇回流脫脂→揮干乙醇→殘?jiān)暡ㄌ崛?超聲波功率700 W、超聲提取時(shí)間50 min、液固比為20∶1)→合并濾液→濃縮(45 ℃、-0.01 MPa)→乙醇沉淀多糖(無水乙醇∶濃縮液=3∶1)→4000 r/min離心10 min,收集沉淀→沉淀加蒸餾水溶解→脫蛋白(1 mg/mL中性蛋白酶加酶量為0.4倍多糖體積、pH7.0、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間3 h)→乙醇沉淀多糖→透析→冷凍干燥(-58 ℃、-0.01 MPa、24 h)得多糖樣品。

1.2.2 DEAE Sephadex A-25柱層析分離純化多糖 DEAE Sephadex A-25經(jīng)預(yù)處理后裝柱(Φ1.5×60 cm)、平衡,將多糖樣品用蒸餾水溶解后配成濃度為4 mg/mL溶液,取3 mL過柱子。洗脫液分別為蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH,流速為2 mL/min,每管收集5 mL,每種洗脫液分別收集40管。每管多糖吸光值采用苯酚-硫酸法[22]測定,并以管號為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)做洗脫曲線圖,根據(jù)洗脫曲線收集各洗脫組分。

1.2.3 多糖純度鑒定

1.2.3.1 紫外光譜掃描鑒定多糖純度 將多糖樣品制成水溶液,于200～400 nm下進(jìn)行掃描,獲得紫外區(qū)光譜。

1.2.3.2 Sephadex G-200對多糖純度的鑒定 將經(jīng)DEAE Sephadex A-25洗脫組分多糖配成2 mg/mL溶液,取2 mL過Sephadex G-200柱,以0.1 mol/L NaCl為流動(dòng)相,流速為0.5 mL/min,檢測多糖純度。

1.2.4 多糖紅外光譜掃描 取多糖樣品5 mg,與200 mg經(jīng)干燥的KBr在瑪瑙研缽中研磨均勻,壓片后用傅立葉變換紅外光譜儀掃描,獲得掃描圖譜。

1.2.5 多糖的單糖組成分析

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)糖測定 將各糖標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解,并按一定比例混合后,過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行糖組成分析。

色譜條件:色譜柱:CarboPac PA20;流速:0.5 mL/min;檢測器:脈沖安培檢測器;流動(dòng)相:水和250 mmol/L NaOH,0～20 min為97.5%水,20～21 min水由97.5%降為20%,之后保持此水平至30 min。

1.2.5.2 多糖樣品單糖組成分析 吸取100 μL濃度為4～5 mg·mL-1的多糖樣品溶液于5 mL的具塞刻度試管中,加入100 μL的4 mol·L-1三氟乙酸(TFA),充N2封管,110 ℃烘箱中水解2 h;冷卻后打開蓋,加200 μL甲醇后用N2吹干,如此重復(fù)加甲醇并用N2吹3次,去除TFA,將其殘?jiān)盟芙舛ㄈ葜? mL,用0.45 μm微孔膜過濾后供進(jìn)樣分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理采用SPSS 24和Origin 9.2進(jìn)行分析,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇菇柄多糖DEAE-Sephadex A-25柱層析純化

雙孢菇菇柄經(jīng)粉碎、超聲波提取、乙醇沉淀和脫蛋白質(zhì)后,通過DEAE-Sephadex A-25層析柱進(jìn)一步分離純化,自動(dòng)部分收集器分部收集,以苯酚-硫酸法逐管檢測多糖。以管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)作圖,洗脫結(jié)果見圖1所示。從圖1可以看出,在洗脫開始,隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增加會有不同的組分被洗脫出來,用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH洗脫時(shí),在490 nm處都出現(xiàn)了吸收峰,其中蒸餾水、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫出來的物質(zhì)量相對較大,將這兩個(gè)洗脫組分分別收集,加入3倍體積的乙醇于4 ℃過夜醇沉后,于4000 r/min離心10 min,收集沉淀,真空冷凍干燥后分別得到淡黃色、淺褐色粉末,并命名為A-25-1、A-25-2。

圖1 雙孢菇菇柄多糖DEAE-Sephadex A-25柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of polysaccharides extracted from A. bisporus stipe by DEAE-Sephadex A-25

2.2 雙孢菇菇柄多糖A-25-1和A-25-2純度的鑒定

2.2.1 紫外光譜鑒定 分別取10.0 mg經(jīng)DEAE-Sephadex A-25柱層析純化后的雙孢菇菇柄多糖組分(A-25-1和A-25-2)溶于10 mL蒸餾水,用UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描,掃描結(jié)果見圖2。由圖可知,A-25-1和A-25-2在260 nm和280 nm處均無明顯吸收峰,表明經(jīng)DEAE-Sephadex A-25柱層析純化后的多糖組分不含核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分。

圖2 A-25-1和A-25-2紫外可見掃描圖譜Fig.2 UV spectra of A-25-1 and A-25-2

2.2.2 Sephadex G-200柱層析光譜鑒定 A-25-1和A-25-2經(jīng)過Sephadex G-200凝膠柱層析的洗脫曲線如圖3。由圖可以看出,雙孢菇菇柄粗多糖經(jīng)DEAE-Sephadex A-25柱層析洗脫后得到的兩個(gè)組分均為單一的洗脫峰,說明其純度較高。

圖3 A-25-1和A-25-2 Sephadex G-200柱層析洗脫曲線Fig.3 Elution profile of A-25-1 and A-25-2 by Sephadex G-200 eluted with 0.1 mol·L-1 NaCl

2.3 雙孢菇菇柄多糖A-25-1和A-25-2紅外光譜分析

對樣品A-25-1進(jìn)行紅外光譜掃描,光譜圖如圖4所示。在糖類化合物中,由于存在多個(gè)羥基,在3570～3050 cm-1通常出現(xiàn)多個(gè)O-H伸縮振動(dòng)吸收峰,這些吸收峰重疊在一起,形成寬的吸收帶,3394.10、3389.28和3247.06 cm-1均位于此吸收帶內(nèi);1640.16 cm-1吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰;1414.53 cm-1處的吸收峰為C-H彎曲振動(dòng)峰;1244.34 cm-1處的吸收峰為酮糖類C-C伸縮振動(dòng);另外在1200～1030 cm-1為C-O鍵的伸縮振動(dòng)峰,由于多糖分子中C-O鍵存在多種形式,因此表現(xiàn)出多個(gè)分叉峰1146.96、1082.83、1039.93 cm-1,這些都是多糖紅外光譜圖的典型特征。在1016.30 cm-1處的吸收峰為吡喃糖環(huán)醚鍵C-O-C,919.40 cm-1附近的吸收峰是典型的吡喃糖β型C-H變角振動(dòng)的特征吸收峰,表明有β-糖苷鍵,因此初步判斷A-25-1樣品為吡喃糖環(huán)β-異構(gòu)體的多糖。

圖4 A-25-1紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of A-25-1

對樣品A-25-2進(jìn)行紅外光譜掃描,光譜圖如圖5所示。在官能團(tuán)區(qū),3420.14 cm-1處表現(xiàn)出典型的分子間締合羥基的振動(dòng)吸收峰,吸收峰強(qiáng)度大;2926.93 cm-1處的吸收峰與C-H的伸縮振動(dòng)相對應(yīng),強(qiáng)度較弱;1626.66 cm-1吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰;1240.49 cm-1處的吸收峰為酮糖類C-C伸縮振動(dòng);另外在1200～1030 cm-1為C-O鍵的伸縮振動(dòng)峰,由于多糖分子中C-O鍵存在多種形式,因此表現(xiàn)出多個(gè)分叉峰1076.08、1049.57 cm-1,這些都是多糖紅外光譜圖的典型特征。776.69 cm-1吸收峰為D-吡喃糖環(huán)β-異構(gòu)體的吸收峰,且在888.06 cm-1處有弱吸收峰存在,該峰位于D-吡喃糖環(huán)β-異構(gòu)體δC1-H(891±7) cm-1區(qū)間,因此初步判斷A-25-2樣品為D-吡喃糖環(huán)β-異構(gòu)體的多糖。

圖5 A-25-2紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of A-25-2

綜合以上分析結(jié)果,經(jīng)DEAE-Sephadex A-25柱層析所得到的水洗脫多糖和0.1 mol/L NaCl洗脫多糖均含有多糖的特征吸收峰,這一結(jié)果與喬德亮等[9]和高宏偉等[23]對雙孢蘑菇子實(shí)體多糖紅外光譜結(jié)果一致;并且經(jīng)柱層析所得兩種多糖均為吡喃糖環(huán)β-異構(gòu)體的多糖,這一結(jié)果與高宏偉等[23]雙孢菇胞內(nèi)和胞外多糖為β-吡喃糖結(jié)果相一致。

2.4 雙孢菇菇柄多糖A-25-1和A-25-2單糖組成

取11種單糖配成混合溶液作為標(biāo)品,將完全水解的多糖樣品A-25-1和A-25-2溶于超純水中,上樣測定,獲得單糖標(biāo)品、樣品A-25-1和A-25-2的離子色譜圖見圖6。對比樣品與標(biāo)樣的離子色譜圖,根據(jù)各峰的保留時(shí)間獲得樣品的單糖組成,雙孢菇菇柄多糖組分A-25-1由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為1.00∶19.02∶1.36∶0.65∶0.21。而A-25-2是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖組成,其摩爾比為1.00∶1.52∶0.27∶0.50∶0.39∶0.21∶0.02∶0.01。這一結(jié)果表明,所得兩種多糖均為雜多糖,這一結(jié)果與高宏偉等[23]雙孢菇多糖為由單一葡萄糖組成的葡聚糖結(jié)果相悖,可能是由于栽培環(huán)境和菌種差異等所致,但與武金霞等[21]和王德宇[20]的研究結(jié)果雙孢菇多糖為雜多糖結(jié)果相類似。

圖6 單糖標(biāo)品(A)及樣品A-25-1(B) 和A-25-2(C)的高效液相色譜圖Fig.6 The HPLC profiles of monosaccharide standards(A)，sample A-25-1(B)and A-25-2(C)

3 結(jié)論

所得脫蛋白雙孢菇菇柄多糖經(jīng)DEAE Sephadex A-25柱層析純化得到兩個(gè)較多的組分,分別為蒸餾水和0.1 mol/L NaCl洗脫,經(jīng)紫外光譜掃描無核酸和蛋白質(zhì),經(jīng)Sephadex G-200柱層析鑒定均為單一峰。

經(jīng)FT-IR紅外光譜分析,所得兩種多糖組分均為吡喃糖環(huán)β-異構(gòu)體的多糖。雙孢菇菇柄水洗脫多糖組分(A-25-1)由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為1.00∶19.02∶1.36∶0.65∶0.21。而0.1 mol/L NaCl洗脫組分(A-25-2)是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖組成,其摩爾比為1.00∶1.52∶0.27∶0.50∶0.39∶0.21∶0.02∶0.01。