高效液相色譜法測定復(fù)方魚腥草膠囊中黃芩苷和黃芩素

李永東

(盤錦華成制藥有限公司，遼寧 盤錦 124205)

復(fù)方魚腥草膠囊是臨床常用的經(jīng)典中成藥，其主要成分為魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花，具有良好的清熱解毒效果，在呼吸道感染等疾病治療中應(yīng)用較多，臨床療效可靠[1-3]。

復(fù)方魚腥草膠囊是本單位復(fù)方魚腥草片改型的重要成果，其清熱解毒效果良好，主要用于外感風(fēng)熱引起的咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃體炎等有風(fēng)熱證候者[4-5]。復(fù)方魚腥草膠囊為純植物藥所制作，其中化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種有效成分，而目前已知黃芩中的黃芩苷和黃芩素為主要活性成分，發(fā)揮了抗菌、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)等重要作用[6-7]。為保證復(fù)方魚腥草膠囊的良好效果，需有效控制其中黃芩苷和黃芩素含量。目前常用中成藥黃芩苷和黃芩素含量檢測方法主要為薄層掃描法和高效液相色譜法，后者檢測準(zhǔn)確性較高，成為當(dāng)前主要的方法[8-10]。

根據(jù)黃芩苷及黃芩素的理化性質(zhì)，選擇274 nm為測定波長，并以乙腈-0.1%甲酸為流動相，梯度洗脫。該方法避免了復(fù)方魚腥草膠囊的含量測定時分別測定黃芩苷及黃芩素，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，可作為復(fù)方魚腥草膠囊產(chǎn)品和生產(chǎn)工藝質(zhì)量的控制手段。

1　儀器與試藥

1.1　儀器

本次研究采用安捷倫科技(中國)有限公司生產(chǎn)的SUMMIT 高效液相色譜儀及CHROMELEONTM 色譜工作站；G1329B自動進(jìn)樣器；G1314B紫外檢測器; FC204 電子天平;KH-400KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器;KQ- 50B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2　試藥

采用中國食品藥品檢定研究院提供的黃芩苷(批號140213-140515，含量91.70%)和黃芩素(批號140598-14897，含量98.5%)對照品；所用試劑為色譜純或分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，其中甲酸(分析純)、甲醇(分析醇)、乙醇(分析醇)、乙腈(色譜純)。本廠自制復(fù)方魚腥草膠囊，成份為魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花。規(guī)格為0.35 g×20粒，批號分別為150425、150623；純化水由本廠提供。

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

樣品中黃芩苷和黃芩素有效分離的色譜條件為：色譜柱為4.6×250 mm的Thermo-C18色譜柱(5 μm)；柱溫為25 ℃；紫外檢測波長為274 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動相為乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫(0～15 min，28%乙腈，72%甲酸；16～40 min，45% 乙腈，55%甲酸；41～45 min，28% 乙腈，72%甲酸)；流速為1.0 mL/min。

2.2　溶液制備

2.2.1對照品儲備液取在60 ℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品110.0 mg，精密稱定，置于200 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶液約150 mL，超聲溶解，再用70%甲醇溶液定容，充分搖勻即得0.550 0 mg/mL黃芩苷儲備液。取在60 ℃減壓干燥4 h的黃芩素對照品11.0 mg，精密稱定，置于100 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶液約70 mL，超聲溶解，再用70%甲醇溶液定容，充分搖勻即得0.110 0 mg/mL黃芩素儲備液。

2.2.2制備混合對照品溶液分別精密吸取黃芩苷對照品儲備溶液9 mL，黃芩素對照品儲備溶液3 mL，于同一25 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，混勻，制成0.198 0 mg/mL黃芩苷、0.013 2 mg/mL黃芩素混合對照品溶液。

2.2.3制備供試品溶液取150425批次的3粒復(fù)方魚腥草膠囊(0.35 克/粒)去膠囊，僅留粉末，充分研細(xì)后，采用分析天平精密稱取6 g藥粉，置入100 mL錐形瓶(有塞)中，精密加入50 mL甲醇溶液(70%)，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min,使用上述甲醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻。取0.45 μm微孔濾膜，將溶液過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4陰性樣品溶液制備按照復(fù)方魚腥草膠囊處方中各味藥材配比，除黃芩外，分別秤取適量的魚腥草、板藍(lán)根、連翹、金銀花4味藥材，按常規(guī)工藝流程制備成藥品，再按照供試品溶液制備方法制成不含黃芩的陰性樣品溶液。

2.3　系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液制備完成后，分別精密量取各溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按本研究色譜條件測定，保留時間為10.239、17.254 min，觀察各溶液的色譜圖；在對照品色譜和復(fù)方魚腥草膠囊供試品色譜圖的相應(yīng)位置，確認(rèn)黃芩苷和黃芩素的吸收峰，兩者與其相鄰色譜峰分離度>1.5，且陰性樣品溶液的色譜圖中未見黃芩苷和黃芩素的吸收峰，可知處方中魚腥草、板藍(lán)根、連翹、金銀花等藥材成分對于測定結(jié)果無影響。混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液的色譜圖分別見圖1。

a：混合對照品;b:供試品;c:陰性樣品

圖1混合對照品、供試品和陰性樣品溶液的高效液相色譜圖

2.4　精密度試驗(yàn)

制備好的混合對照品溶液，按照本次試驗(yàn)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測算黃芩苷和黃芩素峰面積(RSD)，分別為0.426 9%和0.843 9%，儀器精密度良好。

2.5　重復(fù)性試驗(yàn)

取150425批次的18粒復(fù)方魚腥草膠囊(0.35 克/粒)去膠囊，僅留粉末，按上述的供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液。按照方法2.1樣品中黃芩苷和黃芩素有效分離的色譜條件進(jìn)樣，分別測算6組黃芩苷和黃芩素的峰面積，測定平均RSD分別為0.428 1%和0.810 6%；黃芩苷和黃芩素平均含量分別為8.852 1、0.467 9 mg/g，該測量條件下的測量重復(fù)性良好。

2.6　穩(wěn)定性試驗(yàn)

取150425批次的5粒復(fù)方魚腥草膠囊(0.35 克/粒)去膠囊，僅留粉末，取1 g粉末，按上述的供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按照方法2.1樣品中黃芩苷和黃芩素有效分離的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣時刻為分別在0、3、6、9、12、24 h，測算所得黃芩苷峰面積RSD為0.124 1%，黃芩素為0.585 0%，可知樣品中待測成分可在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.7　樣品含量測定

取批號為150425和150623的2批復(fù)方魚腥草膠囊各25粒，去膠囊，僅留粉末，各取6 g粉末，每批取2份，每份精密稱定1 g，按照供試品溶液制備方法制備成供試品溶液。精密吸取對照品溶液和供試品溶液，各10 μL，按照方法2.1樣品中黃芩苷和黃芩素有效分離的色譜條件進(jìn)樣，測算各供試品溶液色譜峰面積，采用按照外標(biāo)點(diǎn)法計(jì)算待測成分的含量。本次研究中，兩個批次的復(fù)方魚腥草膠囊：黃芩苷平均含量分別為 8.486 1、8.443 2 mg/g,黃芩苷色譜峰面積RSD為0.639 8%,0.715 4%；黃芩素平均含量為0.486 8、0.481 3 mg/g,RSD分別為0.847 1%和0.687 2%。150425和150623兩批次復(fù)方魚腥草膠囊黃芩苷和黃芩素的含量基本一致，差別較小，且待測成分的色譜峰面積RSD均<3.5%，可知兩批次藥品質(zhì)量差異較小。

3　討　　論

本次研究對高效液相色譜法測定復(fù)方魚腥草膠囊中黃芩苷和黃芩素含量研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示兩個批次的復(fù)方魚腥草膠囊：黃芩苷平均含量分別為 8.486 1、8.443 2 mg/g,黃芩素平均含量為0.486 8、0.481 3 mg/g，可知兩批次復(fù)方魚腥草膠囊黃芩苷和黃芩素的含量基本一致，差別較小，質(zhì)量水平較高；同時，兩批次產(chǎn)品的黃芩苷色譜峰面積RSD為0.639 8%,0.715 4%；而黃芩素的RSD分別為0.847 1%和0.687 2%，兩種待測成分的色譜峰面積RSD均<3.5%，可知兩批次藥品質(zhì)量差異較小，復(fù)方魚腥草膠囊質(zhì)量控制效果良好，可有效保證藥物療效。

綜上所述，復(fù)方魚腥草膠囊質(zhì)量控制良好，高效液相色譜法測定復(fù)方魚腥草膠囊中黃芩苷和黃芩素含量簡單、準(zhǔn)確，且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，為該藥品質(zhì)量控制提供一條可靠的途徑。