磷灰石涂層用于調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)行為

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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)

0　引　言

周圍神經(jīng)損傷在現(xiàn)代生產(chǎn)生活中極為常見，具有較高的致殘率，給病人、家庭和社會帶來巨大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)損失[1]。如何促進(jìn)受損神經(jīng)的再生和恢復(fù)神經(jīng)功能一直是生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響神經(jīng)再生和修復(fù)的關(guān)鍵因素在于損傷神經(jīng)所在的局部微環(huán)境[2]。因此，大量科學(xué)家致力于創(chuàng)造一些更能滿足神經(jīng)細(xì)胞生長需求的生理環(huán)境，以調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的粘附、遷移、增殖和分化等生物學(xué)行為[3]。隨著組織工程技術(shù)的高速發(fā)展，使用具有良好的生物相容性和生物可降解性的生物材料，并在其表面固定一系列生物活性分子，如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中的層粘連蛋白(Laminin, LN)，逐漸成為調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的有效手段[4-5]。

目前研究中，在生物材料表面固定生物活性分子的常用方法主要為物理吸附法和化學(xué)共價(jià)接枝法[6-7]。Ong等[8]在醫(yī)用鈦表面吸附膠原-骨形態(tài)發(fā)生蛋白，他們發(fā)現(xiàn)改性后的材料促細(xì)胞成骨分化的能力得到了顯著的提高。Yang等[9]在高聚物基底首先制備聚多巴胺涂層，并通過聚多巴胺的活性基團(tuán)共價(jià)固定精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸蛋白質(zhì)多肽，從而成功地促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。運(yùn)用物理吸附法固定生物活性分子，不僅其吸附效率較低，而且固定的生物活性分子易從材料表面快速擴(kuò)散，故該方法在實(shí)際運(yùn)用中比較受到限制[10]?；瘜W(xué)共價(jià)接枝生物活性分子，需要與有機(jī)化學(xué)溶液進(jìn)行繁瑣的交聯(lián)，但可能會破壞基底材料的表面特征并使固定的生物活性分子變性[11]。因此，對于固定生物活性分子，開發(fā)一種簡單而有效的固定化策略至關(guān)重要。

磷灰石是一種天然存在的無機(jī)材料，由于其具有優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，同時(shí)對大量分子具有親和力[12-14]，因此被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過使用磷灰石涂層固定各種生物活性分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞行為[15-17]，將化學(xué)處理后的金屬基底浸入含有CaCl2的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水中，生成多孔結(jié)構(gòu)的磷灰石涂層[16]，該磷灰石涂層的優(yōu)點(diǎn)在于生物活性分子可以通過與磷灰石同時(shí)共沉積來有效控制其用量[18]。此外，多種分子可以共沉積到磷灰石涂層中，并且可以從涂層表面進(jìn)行緩慢而持續(xù)的釋放，從而調(diào)控貼附的細(xì)胞行為。目前的研究表明，以磷灰石涂層作為載體，通過在其表面固定成骨生長肽和纖連蛋白，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附，增殖和成骨分化，并且固定雷帕霉素的磷灰石涂層具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用[16]。對于磷灰石涂層作為載體固定生物活性分子能否運(yùn)用于調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本文在醫(yī)用鈦合金基底仿生制備磷灰石涂層，通過仿生共沉積的方式在磷灰石涂層上固定層粘連蛋白LN，構(gòu)建磷灰石-LN功能性復(fù)合涂層；通過利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡和X射線光電子能譜儀對磷灰石-LN復(fù)合涂層進(jìn)行表征，并對復(fù)合涂層中LN的固定量和釋放情況進(jìn)行研究；同時(shí)探究與復(fù)合涂層共培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞PC12的生物學(xué)行為。

1　材料與方法

1.1　試劑與材料

鈦合金(直徑為10 mm，厚度為1 mm)、氯化鈣溶液(100 mL，美國Sigma公司)、DPBS(不含鈣、鎂，美國Thermo Fisher公司)、層粘連蛋白Laminin(1 mg，美國Sigma公司)、MicroBCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)、CCK-8試劑盒(上海碧云天公司)、live-dead活死染液(美國Thermo Fisher公司)、鬼筆環(huán)肽-FITC(上海碧云天公司)、鬼筆環(huán)肽-羅丹明(美國Thermo Fisher公司)和PC12細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫)。所用試劑均為分析純。

1.2　主要儀器

ULTRA55型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國ZEISS公司)、K-Alpha型X射線光電子能譜儀(美國Thermo Scientific Corporation公司)、酶標(biāo)儀(瑞士TECEN公司)、熒光倒置顯微鏡IX71-22FL/PH(日本Nikon A公司)和激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon A公司)。

1.3　制備磷灰石-LN復(fù)合涂層

用SiC砂紙(600目)仔細(xì)打磨鈦片，之后依次用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗10 min，37 ℃下烘干備用。清洗后的鈦片進(jìn)行堿熱預(yù)處理，具體步驟如下：將其放入水熱反應(yīng)釜中，并用30 mL 1 mol/L NaOH溶液浸泡，于140 ℃下反應(yīng)6 h，堿熱反應(yīng)后得到的樣品稱為活化鈦片，用去離子水對活化鈦片進(jìn)行三次超聲清洗，每次持續(xù)3 min，37 ℃下烘干備用。

量取450 μL CaCl2母液，加入至500 mL Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)溶液中，振蕩至完全溶解，使Ca2+濃度為100 mg/L，配制成本實(shí)驗(yàn)中用于磷灰石涂層制備的仿生礦化液，簡稱為mDPBS(Modified DPBS)溶液。再量取400 μL LN母液，溶解于10 mL mDPBS溶液，配制得到濃度為40 μg/mL的LN溶液，簡稱為mDPBS-LN40。對mDPBS-LN40溶液進(jìn)行濃度梯度稀釋，分別得到20、10 μg/mL和5 μg/mL的LN溶液，簡稱為mDPBS-LN20、mDPBS-LN10和mDPBS-LN5，用于制備磷灰石-LN涂層。

將活化鈦片浸泡在mDPBS溶液中，37 ℃下反應(yīng)24 h；反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水清洗樣品表面，室溫下干燥，得到鈦表面的磷灰石涂層，樣品標(biāo)記為Apatite。將樣品Apatite分別浸泡于1 mL mDPBS-LN5、mDPBS-LN10、mDPBS-LN20和mDPBS-LN40溶液中，25 ℃下反應(yīng)24 h，獲得磷灰石-LN涂層，分別標(biāo)記為Apatite-LN5、Apatite-LN10、Apatite-LN20和Apatite-LN40。

1.4　材料表征

用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)表征鈦表面Apatite涂層的表面形貌設(shè)定掃描電壓為15.0 kV。用X射線光電子能譜儀(XPS)對Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層進(jìn)行表征，檢測兩者的元素含量的差異，設(shè)定測試條件為：掃描型Ar+槍，濺射速率約為94 nm/min，發(fā)射電流為20 mA，能量為4.0 kV。

1.5　磷灰石-LN復(fù)合涂層的LN固定量的檢測

將具有Apatite涂層的鈦片在DPBS-LN溶液浸泡24 h后，收集殘余溶液。浸泡前DPBS-LN溶液為對照組，浸泡后殘余溶液為實(shí)驗(yàn)組Apatite-LN5、Apatite-LN10、Apatite-LN20和Apatite-LN40復(fù)合涂層組，用Micro-BCA試劑盒檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組的LN濃度，計(jì)算出浸泡前LN的不同濃度下，Apatite涂層對LN的固定含量。

1.6　磷灰石-LN復(fù)合涂層的LN的體外釋放實(shí)驗(yàn)

選取Apatite-LN20復(fù)合涂層，將其浸泡在PBS溶液中，分別于浸泡后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和28 d時(shí)收集殘余溶液，通過Micro-BCA試劑盒檢測溶液中LN的濃度，計(jì)算出Apatite-LN復(fù)合涂層的LN的釋放量與LN固定含量的百分比。

1.7　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.7.1磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層的細(xì)胞相容性研究

用CCK-8試劑盒測定Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的生物相容性。其方法是將含有涂層的鈦片滅菌后置于48孔板，用DMEM高糖培養(yǎng)基浸泡72 h，制備出Apatite涂層與Apatite-LN20復(fù)合涂層的浸提液。將PC12細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，12 h后吸取培養(yǎng)基，分別添加Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的浸提液、新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)基和0.64%的苯酚。Apatite涂層與Apatite-LN20復(fù)合涂層的浸提液為實(shí)驗(yàn)組，新鮮培養(yǎng)基和0.64%的苯酚組分別為陰性和陽性對照組。換液培養(yǎng)24 h和48 h后，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，在波長450 nm處用酶標(biāo)儀測取OD值，記錄結(jié)果，并計(jì)算平均值。

將PC12細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于48孔板，12 h后吸取培養(yǎng)基，分別添加Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的浸提液、新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)基和0.64%的苯酚。換液培養(yǎng)24 h和48 h后，進(jìn)行l(wèi)ive-dead細(xì)胞染色法對細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察。

1.7.2磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層對細(xì)胞貼附性能的研究

將含有Apatite涂層與Apatite-LN5、Apatite-LN10、Apatite-LN20和Apatite-LN40復(fù)合涂層的鈦片滅菌后置于48孔板，之后將PC12細(xì)胞以4×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于涂層表面，種植于48孔板表面的細(xì)胞作為對照組，在無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中孵育4 h。采用CCK-8試劑盒定量檢測PC12細(xì)胞在涂層表面的貼附情況，利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。并進(jìn)行鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI雙染來觀察PC12細(xì)胞在涂層表面貼附的形貌。

1.7.3磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層對細(xì)胞增殖性能的研究

將含有Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的鈦片滅菌后置于48孔板，之后將PC12細(xì)胞以2×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于涂層表面，種植于48孔板表面的細(xì)胞作為對照組，在DMEM高糖培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1、3 d和5 d。采用CCK-8試劑盒定量檢測PC12細(xì)胞在涂層表面增殖1、3 d和5 d的情況，利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；通過鬼筆環(huán)肽-羅丹明/DAPI雙染來觀察PC12細(xì)胞在涂層表面增殖5 d的形貌。

2　結(jié)果與討論

2.1　磷灰石涂層的形貌分析

堿熱預(yù)處理后的鈦片浸泡于DPBS溶液中24 h后，實(shí)驗(yàn)過程中肉眼可觀察到其表面形成一層肉眼可見的白色涂層。圖1為涂層的FE-SEM圖，結(jié)果顯示，該涂層由一種多孔均一的片層狀結(jié)構(gòu)晶體組成，與先前研究中觀察到的結(jié)果相一致[15]。Apatite涂層這種彼此相連的微孔結(jié)構(gòu)，使其具有一定的固定生物活性分子的能力，從而能夠構(gòu)建Apatite-LN復(fù)合功能性涂層。

圖1　鈦表面Apatite涂層的FE-SEM圖

2.2　磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層的N元素含量分析

表1為通過XPS所檢測的Apatite涂層與Apatite-LN5、Apatite-LN10、Apatite-LN20、Apatite-LN40復(fù)合涂層的各種元素含量的比較，由表可見，Apatite涂層中由于不含有LN而無法檢測到N元素，而Apatite-LN復(fù)合涂層的N元素含量顯著提高，并且隨著LN濃度的提高，Apatite-LN復(fù)合涂層中所能檢測到的N元素含量也逐漸提高，表明LN被成功地共沉積到Apatite涂層上。

表1　Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的所含元素分析　%

2.3　磷灰石-LN復(fù)合涂層的LN固定量的分析

通過Micro-BCA試劑盒，對于實(shí)驗(yàn)組Apatite-LN5、Apatite-LN10、Apatite-LN20和Apatite-LN40復(fù)合涂層組和對照組LN濃度的檢測與計(jì)算，結(jié)果如表2所示；在LN原始濃度分別為5、10、20 μg/mL和40 μg/mL時(shí)，磷灰石涂層所能固定的LN含量分別為1.43、3.96、4.14 μg和5.88 μg。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Apatite涂層這種多孔的微晶結(jié)構(gòu)對于LN分子具有比較良好的固定性能。

表2　Apatite涂層中LN含量的分析

2.4　磷灰石-LN復(fù)合涂層的LN的體外釋放的分析

將Apatite-LN20復(fù)合涂層，將其浸泡在PBS溶液中6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和28 d后，對涂層中LN在PBS溶液中的釋放量進(jìn)行計(jì)算對比，結(jié)果如圖2所示。圖2表明，LN分子在14 d內(nèi)進(jìn)行相對快速地釋放，14 d的釋放量達(dá)到19.75%，隨后LN分子基本保持了相對較為緩慢的釋放率，直到釋放實(shí)驗(yàn)至28 d，其釋放量達(dá)到20.72%，這表明固定的LN分子是從涂層表面緩慢而持續(xù)地釋放出來，達(dá)到較好的緩釋效果。通過物理吸附方式在材料表面固定的蛋白分子在短時(shí)間內(nèi)會進(jìn)行暴釋，而仿生共沉積的LN分子1 d和3 d的釋放量較低，分別為3.47%和3.82%；同時(shí)有研究表明，仿生共沉積的熒光標(biāo)記蛋白在磷灰石涂層內(nèi)部可被直接觀察，且共沉積蛋白后的涂層為碳化的磷灰石涂層[19]，因此固定于涂層中的LN分子可能不是簡單的吸附在其表面，而是參與到涂層的晶格構(gòu)建中。

圖2　Apatite-LN復(fù)合涂層中LN的釋放量

2.5　磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層對神經(jīng)細(xì)胞PC12的生物學(xué)行為的研究分析

2.5.1磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層的細(xì)胞相容性研究分析

圖3為CCK-8檢測結(jié)果，結(jié)果表明：與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)24 h后，Apatite和Apatite-LN組的PC12細(xì)胞活力分別為119.73%和148.96%；實(shí)驗(yàn)48 h后，其細(xì)胞活力稍稍降低，分別為108.91%和114.35%。這明顯高于根據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)(ISO 10993-5-2009)所設(shè)定的70%的細(xì)胞毒性閾值[20]。這表明，與陰性對照相比，Apatite涂層和Apatite-LN復(fù)合涂層浸提液，有利于細(xì)胞生長。而與Apatite組相比，Apatite-LN組的細(xì)胞活力相對有所提高，其原因可能由于在制備Apatite-LN復(fù)合涂層浸提液的過程中，LN從中釋放出來，在一定程度上，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞PC12的生長。

圖3　Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層浸提液對PC12細(xì)胞生長影響的分析

圖4為PC12細(xì)胞dead/live染色圖，從圖中可以看出，陰性對照、Apatite涂層和Apatite-LN復(fù)合涂層活細(xì)胞數(shù)目較多，與CCK-8檢測結(jié)果相一致，表明Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的細(xì)胞相容性比較優(yōu)異。

2.5.2磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層對細(xì)胞貼附性能的分析

PC12細(xì)胞在無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，對Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層上貼附的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖5所示。

圖4　Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的浸提液培養(yǎng)后的PC12細(xì)胞dead/live染色

從圖5中可以看出，Apatite涂層表面貼附的PC12細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組，而固定LN分子后的Apatite-LN復(fù)合涂層表面貼附的PC12數(shù)量則明顯增大。其中，Apatite-LN5組材料的促細(xì)胞貼附能力接近于對照組，而Apatite-LN10、Apatite-LN20和Apatite-LN40組材料的促細(xì)胞貼附能力均優(yōu)于對照組，且隨著Apatite涂層結(jié)合的LN的增加，涂層表面促PC12細(xì)胞貼附能力逐漸增強(qiáng)。這說明，Apatite涂層能夠作為固定LN分子的有效載體，具有應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞生長的潛在價(jià)值。本文通過鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI雙染法來觀察PC12細(xì)胞在Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的貼附形貌，結(jié)果如圖6所示。圖6中可見貼附在Apatite涂層的細(xì)胞最少，當(dāng)Apatite涂層固定有LN分子時(shí)，更多的細(xì)胞貼附在樣品表面，且隨著LN濃度的增加，細(xì)胞貼附數(shù)目逐漸增多，與圖3所述的細(xì)胞貼附的定量檢測結(jié)果一致。并且，Apatite-LN40組貼附的細(xì)胞在樣品表面鋪展良好，可以明顯觀察到細(xì)胞呈梭形且伸出偽足，這能進(jìn)一步提升細(xì)胞的貼附性能。細(xì)胞的早期貼附對于隨后的增殖是極其重要的，LN作為一種細(xì)胞粘附蛋白，可以促進(jìn)細(xì)胞的貼附，并且對于細(xì)胞的貼附形貌和細(xì)胞的功能至關(guān)重要。

圖5　PC12細(xì)胞貼附于Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的定量分析注：**表示p<0.01，分別對Apatite組和其他組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖6　PC12細(xì)胞貼附于Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色

2.5.3磷灰石涂層與磷灰石-LN復(fù)合涂層對細(xì)胞增殖性能的研究分析

經(jīng)過5 d的PC12細(xì)胞與Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層的共培養(yǎng)和CCK-8實(shí)驗(yàn)的檢測，結(jié)果如圖7所示。細(xì)胞在Apatite涂層、Apatite-LN復(fù)合涂層上展現(xiàn)出較好的增殖。細(xì)胞增殖1 d后，對照組細(xì)胞的增殖水平明顯高于Apatite和Apatite-LN組(p<0.05)。Apatite-LN復(fù)合涂層上種植的細(xì)胞在1 d后開始進(jìn)入增殖速率較快速的增殖期，并且在第3 d后，種植于Apatite-LN復(fù)合涂層表面的細(xì)胞增殖情況與對照組已無明顯差異(p>0.05)。第5 d時(shí)，Apatite-LN復(fù)合涂層上的細(xì)胞增殖數(shù)目與對照組幾乎持平(p>0.05)。Apatite涂層上的細(xì)胞處于不斷增殖狀態(tài)，然而，在增殖1、3 d和5 d時(shí)，細(xì)胞增殖水平仍然明顯低于對照組和Apatite-LN組(p<0.05)。這說明，Apatite涂層能夠維持神經(jīng)細(xì)胞PC12的生長增殖，而固定有細(xì)胞粘附蛋白的Apatite-LN復(fù)合涂層由于其表面的LN分子的緩慢持續(xù)釋放，從而表現(xiàn)出對于神經(jīng)細(xì)胞PC12的良好促增殖能力。

圖7　PC12細(xì)胞于Apatite涂層與Apatite-LN復(fù)合涂層上培養(yǎng)不同時(shí)間的定量分析注：*表示p<0.05，分別對對照組、Apatite組和Apatite-LN組兩兩進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

細(xì)胞生長至第5 d的鬼筆環(huán)肽-羅丹明/DAPI染色結(jié)果如圖8所示，結(jié)果顯示：在Apatite-LN復(fù)合涂層上的細(xì)胞數(shù)目明顯較純Apatite涂層多，與CCK-8實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果相一致；種植于Apatite-LN復(fù)合涂層的細(xì)胞鋪展良好，較多的PC12細(xì)胞長有突起和樹枝狀的細(xì)胞連接，呈現(xiàn)出神經(jīng)元樣的外觀形貌；而種植于純Apatite涂層上的細(xì)胞未明顯見到神經(jīng)突的形成。以上結(jié)果證實(shí)：Apatite-LN復(fù)合涂層持續(xù)釋放的LN分子能夠形成促進(jìn)神經(jīng)突生長的環(huán)境，固定有細(xì)胞粘附蛋白的Apatite-LN復(fù)合涂層是適合神經(jīng)細(xì)胞貼附和生長的材料，具有一定的神經(jīng)相容性。

圖8　PC12細(xì)胞于涂層上培養(yǎng)5 d后的鬼筆環(huán)肽-羅丹明/DAPI染色圖

3　結(jié)　論

本文運(yùn)用仿生共沉積法在Apatite涂層表面固定LN分子，構(gòu)建Apatite-LN功能性復(fù)合涂層。首先對涂層的微觀形貌和化學(xué)組成進(jìn)行了檢測和分析；其次，對涂層的蛋白固定性能和緩釋性能進(jìn)行了研究；最后探究與涂層共培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞PC12的生物學(xué)行為，主要研究結(jié)論如下：

a) FE-SEM結(jié)果表明，通過仿生礦化法可以制備出多孔均一的Apatite涂層，并且XPS N元素檢測結(jié)果顯示，運(yùn)用仿生共沉積法可以在其表面固定LN分子，形成Apatite-LN復(fù)合涂層。

b) 通過蛋白定量檢測可知，當(dāng)?shù)鞍自紳舛确謩e為5、10、20 μg/mL和40 μg/mL時(shí)，Apatite-LN復(fù)合涂層中的蛋白含量約為1.31、3.90、4.20 μg和4.55 μg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文采用的仿生礦化共沉積法能夠在Apatite涂層上迅速有效地共沉積LN分子。

c) Apatite-LN復(fù)合涂層中LN分子體外釋放結(jié)果表明，LN保持相對較為緩慢的釋放率，在體外可以進(jìn)行持續(xù)可控的釋放，直到釋放實(shí)驗(yàn)至28 d，其釋放量約為20.72%。

d) 通過神經(jīng)細(xì)胞PC12的體外培養(yǎng)研究表明，Apatite-LN涂層的生物相容性比較優(yōu)異，且仿生共沉積的LN分子能夠顯著地提高PC12細(xì)胞的貼附和鋪展能力，并能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞的增殖和突觸形成。

本文制備的Apatite/LN涂層對蛋白分子具有良好的固定能力；對于所固定的蛋白分子達(dá)到比較優(yōu)異的緩釋效果；在對神經(jīng)細(xì)胞PC12的培養(yǎng)、貼附和增殖方面起到一定的促進(jìn)作用，顯示Apatite涂層可作為生物分子的有效載體，在調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長以及周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。