透明質(zhì)酸酶的研究進(jìn)展

韓旭

【摘 要】透明質(zhì)酸酶是一類能夠降解透明質(zhì)酸酶的酶的總稱，廣泛分布于自然界，存在于哺乳動(dòng)物、昆蟲、水蛭和細(xì)菌中。近年來，關(guān)于透明質(zhì)酸酶的研究逐漸增多，其在醫(yī)學(xué)、整形等領(lǐng)域的應(yīng)用受到人們的重視。文章介紹了透明質(zhì)酸酶的研究進(jìn)展，對于其分類、來源、活性測定和應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

【關(guān)鍵詞】透明質(zhì)酸酶；分類；來源；活性測定；應(yīng)用

透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidases， 簡稱HAase）是一種廣泛分布、能夠降解透明質(zhì)酸（HA）產(chǎn)生低分子化的酶的總稱[1]，大多數(shù)能夠降解硫酸軟骨素（Chondroitin，CS），但速度較低。最初發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶，是在1928年，發(fā)現(xiàn)睪丸及其他組織中的提取物，通過促進(jìn)其他有害的毒液成分的滲透和增強(qiáng)它們在血液中的行動(dòng)不變性組織，發(fā)揮“擴(kuò)散因子”的作用。1940年，Meyer將這種“擴(kuò)散因子”正式命名為Hyaluronidase。不同來源的HAase具有一定的差異性，但從其被發(fā)現(xiàn)以來，逐漸獲得了人們的關(guān)注，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域。也基于此，HAase的性質(zhì)等相關(guān)研究成為了一個(gè)值得關(guān)注的領(lǐng)域。

一、透明質(zhì)酸酶酶的分類

根據(jù)透明質(zhì)酸的作用機(jī)理，將HAase分為三種類型（Meyer， 1971）：（a） 內(nèi)酰胺-β- N -乙酰- D - 氨基葡糖苷酶（EC 3.2.1.35）：該酶屬于水解酶，將高分子量底物（HA）作為主要末端產(chǎn)物的通過內(nèi)切的作用方式，作用于β-1，四糖苷鍵進(jìn)行水解，降解后得到的終產(chǎn)物主要為飽和的四糖和六糖。來自于膜翅目（Hymenoptera）毒液和哺乳動(dòng)物精子等動(dòng)物來源的均屬于此類。該的酶也催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，在HA的水解期間產(chǎn)生六糖和八糖。與后面兩種透明質(zhì)酸酶不同的是，這一組不僅作用于HA，還作用于硫酸軟骨素。（b） β-葡糖苷酸酶（EC 3.2.1.36）：來源于水蛭和鉤蟲中，屬于水解酶，通過內(nèi)切作用方式，作用于β-1，3糖苷鍵，降解后得到的終產(chǎn)物為四糖，且該酶為特異性降解HA。（c） 透明質(zhì)酸裂解酶（hyaluronate lyase，簡稱HL）（EC 4.2.2.1）：多數(shù)是以細(xì)菌為代表的，還包括真菌和病毒來源的一組酶，通過β-消除機(jī)制的N-乙酰己糖胺酶，通過作用于β-1，4 糖苷鍵，在C-4和C-5之間引入不飽和鍵。與前兩種HAase不同，HL的最終產(chǎn)物是二糖而不是四糖或六糖。不同菌屬來源的HL，在底物特異性上表現(xiàn)有所不同。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，還可以將HAase分為兩大類，依據(jù)其蛋白同源性，將其分為真核生物來源的HAase和原核生物來源的HAase。

二、透明質(zhì)酸酶的來源

透明質(zhì)酸酶的來源廣泛，分布于各種脊椎動(dòng)物（睪丸、動(dòng)物毒液等）和無脊椎動(dòng)物（昆蟲、水蛭，十二指腸蟲等）中，還存在于微生物中（鏈霉菌屬，葡萄球菌屬、梭菌屬等）。

（一）真核生物來源的HAase

在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了六種HAase-相似序列的基因編碼，它們都顯示出高度的同源性。它們包括人類的HYAL-1、HYAL-2、HYAL-3、HYAL-4和PH20，以及在人類中轉(zhuǎn)錄但未翻譯的假基因HYAL-Phyal1。前三個(gè)來源于人的HAase基因（HYAL-1、-2、-3）聚集在染色體3p21.3位點(diǎn)，而后者的3個(gè)基因在染色體7q31.3位點(diǎn)上聚集。在此基礎(chǔ)上，HAases被分為兩部分。它們大多數(shù)被認(rèn)為是酸性的，因?yàn)樗鼈兊幕钚栽谒嵝詶l件下最高。相反，PH20是中性活躍的HAase，因?yàn)樗谥行?pH中活性最高的，商品化的重組人透明質(zhì)酸酶的氨基酸序列是PH20，其在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是已發(fā)現(xiàn)的人類透明質(zhì)酸酶唯一一個(gè)最適宜體內(nèi)的中性生理環(huán)境同時(shí)保持高活性的酶[2，3]。2015年，美國FDA批準(zhǔn)一種名為Halozyme的重組人類透明質(zhì)酸酶注射劑，作為其他注射藥物的輔助藥物，用于皮下注射等促進(jìn)藥物擴(kuò)散和吸收，但是重組人透明質(zhì)酸酶價(jià)格昂貴，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，市面上目前只有國外能夠購買到該種酶，且由于其的免疫原性，使之不能隨意購買，因此想要使其能夠在我國醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛使用，現(xiàn)在的情況不是很樂觀。

目前市售的HAase中應(yīng)用最為全面的是來自于牛睪丸提取的透明質(zhì)酸酶（bovine testicular hyaluronidase， 簡稱BTH），最初是PrimaPharm公司研制的純化牛睪丸透明質(zhì)酸酶。BTH為中性HAase，主要將HA降解，終產(chǎn)物四糖和飽和二糖，且其還可以降解其他種類的糖胺聚糖硫酸軟骨素。但提取后的該酶純度低，摻雜了許多雜蛋白，無法保證酶的純度，且其由于來源于動(dòng)物，具有較強(qiáng)的免疫原性，容易引起過敏反應(yīng)。

來自水蛭和十二指腸蟲等的β-葡糖苷酸酶（EC 3.2.1.36）作用于β-1-3糖苷鍵之間。這種類型的酶還有待進(jìn)行深入研究。其水解降解機(jī)制類似于脊椎動(dòng)物的HAase。然而，在研究它們的催化機(jī)理時(shí)，該類型的酶與脊椎動(dòng)物的HAase降解模式的差異仍然存在。

（二）原核生物來源的HAase

在CAZy數(shù)據(jù)庫中，微生物來源的透明質(zhì)酸酶屬于多糖裂解酶第8、16家族（PL8、PL16），有些噬菌體也能產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶，但是它的分子量遠(yuǎn)小于細(xì)菌HAase的分子量，而且在胞外環(huán)境下測得的活性很低。

多種細(xì)菌、噬菌體、真菌可表達(dá)產(chǎn)生HL，通常稱其為消除酶或裂解酶（EC 4.2.2.1），通過β消除機(jī)制引入不飽和雙鍵。很多細(xì)菌都可以產(chǎn)生HL，其中革蘭氏陽性菌（Gram-positive，G+），經(jīng)報(bào)道，大多屬于致病菌例如鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、[4， 5]等，這些致病菌通過動(dòng)物或人類的皮膚擦傷，逃過其防衛(wèi)機(jī)制引起感染。過程是其將自身的HL分泌到胞外通過降解宿主體內(nèi)的透明質(zhì)酸，使宿主體內(nèi)的高分子HA參與免疫調(diào)節(jié)且具有抗炎活性，而微生物產(chǎn)生的HL將高分子HA降解成寡聚透明質(zhì)酸，使其作為炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，在宿主體內(nèi)建立適合該細(xì)菌自身的生長環(huán)境，使宿主患滑膜炎、敗血癥等的風(fēng)險(xiǎn)大大提高。而來自革蘭氏陰性菌（Gram-negative，G-）中的HL，則屬于周質(zhì)酶，為胞內(nèi)酶，在發(fā)病機(jī)制中起作用的可能性較小，其中一些HL也有較低的軟骨素裂解酶活性。細(xì)菌和真菌來源的HL，分子量一般較大，而細(xì)菌來源的酶純化工藝較簡單，且來源更廣，成本較低，因此其市場應(yīng)用價(jià)值更高。許多噬菌體產(chǎn)生的酶通常隨噬菌體附于細(xì)菌膜表面，膜中所富含的HA利于其生長，通過初始的非漸進(jìn)性的內(nèi)溶活性來消化HA，然后以不飽和二糖作為最終產(chǎn)物。

病毒來源的HL蛋白序列與細(xì)菌來源的相似性極低，且分子量遠(yuǎn)小于細(xì)菌和真菌來源的。研究發(fā)現(xiàn)，有些不飽和透明質(zhì)酸寡糖，例如由噬菌體透明質(zhì)酸酶HylP[6]產(chǎn)生的不飽和透明質(zhì)酸寡糖，不僅不會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長，還可以減少乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和入侵，因此可能可以利用HylP獨(dú)特的酶活性抑制透明質(zhì)酸介導(dǎo)的腫瘤生長和進(jìn)展。來源于釀膿鏈球菌的透明質(zhì)酸裂解酶對降解HA后得到不飽和透明質(zhì)酸具有一定的抗氧化活性，而這些功能是飽和透明質(zhì)酸片段無法達(dá)到的，因此微生物產(chǎn)生的HL對于降解產(chǎn)生不飽和透明質(zhì)酸寡糖的這些特殊的生物學(xué)功能具有更廣闊的應(yīng)用前景。

三、透明質(zhì)酸酶活性的測定方法

隨著對透明質(zhì)酸酶的深入研究，經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，常見測定透明質(zhì)酸酶活性的方法很多，如ELISA-like法、平板法、化學(xué)修飾法和毛細(xì)管電泳法等諸多方法。但應(yīng)用較多的是濁度法、3，5-二硝基水楊酸法（3，5-dinitrsalicylic，DNS）和232nm法等方法。

濁度法：大分子量的透明質(zhì)酸鹽在酸化血清中能夠發(fā)生沉降現(xiàn)象，但是經(jīng)過降解的HA在相同條件下仍然澄清。經(jīng)過不斷的研究，對濁度法不斷修正，發(fā)現(xiàn)馬、兔和人血清、血清白蛋白、牛血清白蛋白、十六烷基三甲基溴化氨和西吡氯銨等均可以作為蛋白沉淀試劑均可以用來測定酶活性，可使用馬血清作為沉淀劑。美國藥典（采用馬血清作為沉淀劑，透明質(zhì)酸酶是以USP標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸酶（USP Hyaluronidase Reference Standard）為標(biāo)準(zhǔn)酶進(jìn)行酶活測定。中國藥典（版）也是釆用血清作為與反應(yīng)的沉淀劑，以標(biāo)準(zhǔn)酶作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行酶活測定。酶活定義：在特定溫度條件下，0.1mg HA 在30min內(nèi)引起的濁度降低50%引起的濁度變化所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

DNS法：3，5-二硝基水楊酸法（3，5-dinitrsalicylic，DNS法），原理是在堿性環(huán)境中DNS與透明質(zhì)酸酶的降解產(chǎn)物的還原性末端發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物煮沸后呈現(xiàn)紅棕色，顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖含量呈線性關(guān)系，還原糖含量越高，顏色差越明顯，585nm下檢測獲得還原性糖的量來反映酶活力。酶活力定義：以每10min產(chǎn)生1nM還原糖需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

232nm法：糖胺聚糖裂解酶與糖胺聚糖底物反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生不飽和雙鍵，這種不飽和雙鍵在232nm處具有光吸收，在一定范圍內(nèi)，吸光度值與不飽和雙鍵的含量呈線性關(guān)系，因此可以通過測定OD232下光吸收的數(shù)值來檢測底物中不飽和雙鍵的數(shù)量，進(jìn)而顯示產(chǎn)物的生成量來確定酶活力的大小。酶活力定義為：每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶用量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

四、透明質(zhì)酸酶的應(yīng)用

首先，可以應(yīng)用透明質(zhì)酸酶來制備低分子透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸寡糖，從而使低分子透明質(zhì)酸（LMWHA）和透明質(zhì)酸寡糖（o-HA）可以發(fā)揮其生物學(xué)功能，促進(jìn)新生血管生成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抑制腫瘤等作用。有報(bào)道表明HAase降解產(chǎn)生的o-HA可以促進(jìn)預(yù)產(chǎn)大鼠子宮頸收縮，從而縮短生產(chǎn)過程，HAase還有助于恢復(fù)大鼠損傷的脊髓的功能。

其次，由于最初作為“擴(kuò)散因子”被發(fā)現(xiàn)，因此，透明質(zhì)酸酶可以與其它藥物共同作用進(jìn)行給藥，促進(jìn)藥物的擴(kuò)散和吸收。當(dāng)用作為單次短期作用劑量，暫時(shí)地去除可被用來增強(qiáng)將溶液和藥物吸收入組織，使其組織液的黏度降低，從而增加膜的通透性將藥物傳送入間質(zhì)空間。HAase對于麻醉劑的擴(kuò)散是有效的，有助于治療性流體、分子和蛋白質(zhì)的治療性的物質(zhì)的擴(kuò)散給藥。

HAase可以用于眼科手術(shù)幫助麻醉，青光眼、白內(nèi)障手術(shù)中有效控制眼壓，視網(wǎng)膜玻璃體手術(shù)中降低HA的粘滯性有效降低手術(shù)危險(xiǎn)。整形美容領(lǐng)域，透明質(zhì)酸酶用于除皺或者面部注射透明質(zhì)酸除皺后不良反應(yīng)的后處理等。通過將人的HAase基因PH20與溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus，OAV）整合，使HAase發(fā)揮作用，降解HA，促進(jìn)OAV在腫瘤細(xì)胞中的擴(kuò)散，使腫瘤減小，提高療效[7]。人重組HAase-rhPH20還可以用于糖尿病治療中，可加速胰島素的擴(kuò)散，更快達(dá)到最高作用，有效控制了糖尿病人的血糖濃度。同時(shí)，HAase具有很強(qiáng)的生血作用，增強(qiáng)血管的通透性，從而使藥物更容易暴露，由于HAase的各種作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床中。

五、總結(jié)

透明質(zhì)酸酶是一種廣泛分布和被忽視的酶，具有不同的底物特異性，廣泛的pH值，不同的催化機(jī)制和各種各樣的功能。然而，在這一領(lǐng)域已經(jīng)做了許多的工作，但在酶學(xué)方面仍然有很多工作要做，特別是三維結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)突變和酶促動(dòng)力學(xué)，以增強(qiáng)對結(jié)合位點(diǎn)、底物識(shí)別和催化機(jī)制的理解。克隆更多的重組酶可以確定這些透明質(zhì)酸酶的分類和聯(lián)系。進(jìn)一步研究純化后的透明質(zhì)酸酶的底物的結(jié)構(gòu)，以提高對酶的協(xié)同作用的理解。關(guān)于表達(dá)調(diào)控有許多未解的問題，包括完整的基因序列、協(xié)調(diào)調(diào)控的程度以及對假定誘導(dǎo)物反應(yīng)的分子機(jī)制。隨著研究的深入，不同來源透明質(zhì)酸酶的特性被逐漸發(fā)掘，這些為預(yù)防和治療透明質(zhì)酸酶相關(guān)疾病提供新的途徑和理論依據(jù)。

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