生后不同間隔時間異氟烷處理對大鼠成年后認知功能的影響

鄧城旗，楊靜，房曉燕，郝濟偉，張慶紅，孟令超，唐家廣，李萌萌

隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，越來越多的嬰幼兒接受手術麻醉。目前研究顯示，全身麻醉藥物對生后發(fā)育期大腦可產(chǎn)生短暫或長期的影響[1-3]。2016年底，美國食品與藥品管理局(FDA)發(fā)布警示：3歲以下兒童或妊娠后3個月的孕婦在手術或操作過程中反復或長期使用全身麻醉和鎮(zhèn)靜藥物可能會影響兒童的大腦發(fā)育[4]。對于那些需要多次手術麻醉的嬰幼兒，調整手術間隔時間能否減弱或消除多次麻醉對認知功能造成的影響目前尚不明確。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，多次異氟烷處理對發(fā)育期大鼠隨后的認知功能存在一定影響，延長間隔時間可緩解短期的認知損害[5-6]。本研究進一步觀察了生后多次異氟烷處理對發(fā)育期大鼠成年后空間認知功能的影響，探索能否通過改變手術治療的間隔時間保護成年后的認知功能，以期為臨床制定合理的診療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 生后7d的SD大鼠48只，購自北京協(xié)和醫(yī)院動物實驗室，合格證編號：11401300014294。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為Naive組、G6h組、G2h-1d和G2h-3d組，每組12只，雌雄比為5:7。實驗前測量幼鼠體重，然后置于透明有機玻璃麻醉誘導盒中，Naive組幼鼠自由呼吸空氣6h；G6h組幼鼠采用異氟烷處理6h；G2h-1d組幼鼠采用異氟烷處理，每次2h，每次間隔1d，共處理3次；G2h-3d組幼鼠采用異氟烷處理，每次2h，每次間隔3d，共處理3次。

本實驗方案通過本院動物倫理委員會批準，動物處置過程中所有操作均符合動物倫理學標準。

1.2 異氟烷處理[5]應用實驗動物麻醉機(美國MATRX公司)，以3%異氟烷(山東魯南貝特，生產(chǎn)批號64140302)誘導，1.5%異氟烷與30%氧氣混合吸入維持麻醉。監(jiān)測幼鼠呼吸頻率，每15min夾尾確認其存活，采用ALC-HTP動物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特)維持幼鼠體溫在36.5±0.5℃，開啟CO2吸附器吸收廢氣。

1.3 檢測指標及方法 于大鼠生后7、21、98d測量體重，觀察其發(fā)育情況。麻醉后每組取1只幼鼠采集心臟血進行血氣分析；然后飼養(yǎng)至成年。在91、98、119d分別進行曠場實驗、八臂迷宮及Morris水迷宮行為學測試。應用EthoVision XT軟件跟蹤軌跡系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)記錄大鼠的行為學表現(xiàn)。

1.3.1 曠場實驗[7]將大鼠放置于場地中央，實時攝像記錄其5min的行為，應用EthoVision XT軟件分析中央?yún)^(qū)域(半徑≤5cm)耗時、周邊區(qū)域(半徑＞5cm)耗時、角落區(qū)域耗時、穿梭中央?yún)^(qū)域次數(shù)、速度及總路程，以評價大鼠的探索、焦慮及自主行為等。

1.3.2 八臂迷宮測試[5,8]用于評估大鼠的空間記憶能力。采用成年大鼠迷宮(長425mm，寬145mm，高225mm)進行測試，分為以下3步。①適應階段：大鼠放入迷宮中央平臺適應2min后，依次打開八臂閥門，讓其自由攝食；②訓練階段：隨機選取四臂的前、中、后放置巧克力，待大鼠吃完或10min后將其取出，乙醇去除異味，每日1次，連續(xù)5d；③測試階段：選定訓練時的四臂末端放入巧克力，以大鼠吃完或耗時10min作為測試結束，每日2次，間隔1h以上，連續(xù)5d，共10次。記錄大鼠在迷宮中表現(xiàn)，包括錯誤次數(shù)[指大鼠進入不曾放過食粒的臂，也稱參考記憶錯誤(reference memory error，RME)，反映動物的長期記憶]、重復錯誤次數(shù)[指在同一次測試中大鼠再次進入已經(jīng)吃過食粒的臂，也稱工作記憶錯誤(working memory error，WME)，反映動物的臨時記憶]、入臂總次數(shù)(指動物吃完所有食物進入臂的總次數(shù))和入臂總耗時(指動物吃完所有食粒所用時間或10min測試結束)。

1.3.3 Morris水迷宮測試[5,9]用于評價大鼠與空間學習記憶相關的腦區(qū)功能，測試分為以下3步。①環(huán)境適應：大鼠在水迷宮實驗室自由攝食飲水，每日2h；②定位航行訓練：水溫維持在26±1℃，將大鼠頭朝池壁放入水中，隨機取東、西、南、北4個方向之一，每日4次，間隔15～20min；③空間探索測試：大鼠由原平臺對側象限放入池中1min，記錄大鼠進入各象限耗時、平臺潛伏期、穿梭平臺次數(shù)、平臺耗時和速度。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用完全隨機方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗和Dunnett t檢驗；計數(shù)資料以大于或小于中位數(shù)的率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 隨日齡增長，各組大鼠體重增加，組間及組內雌/雄成鼠體重比較均無明顯差異(P＞0.05)，而98d時雄鼠體重明顯高于雌鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，提示生后發(fā)育期不同方式異氟烷處理對大鼠生長發(fā)育無明顯影響，成年后雄鼠體重高于雌鼠，符合正常生理狀況[10]。發(fā)育期異氟烷處理后，各組間雌/雄幼鼠血氣分析指標比較均無明顯差異(P＞0.05)，提示異氟烷處理未導致幼鼠出現(xiàn)低氧血癥、高二氧化碳血癥等，排除其可能的影響。

2.2 曠場實驗結果 與Naive組相比，各處理組大鼠在曠場實驗中的表現(xiàn)均無明顯差異，不同性別大鼠的曠場實驗表現(xiàn)中的比較亦無明顯差異(P＞0.05，表1)，提示發(fā)育期異氟烷處理對大鼠成年后焦慮、探索等自主行為無明顯影響。

表1 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年大鼠曠場實驗結果的影響 (±s)Tab. 1 Effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of open field tests in adult rats (±s)

表1 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年大鼠曠場實驗結果的影響 (±s)Tab. 1 Effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of open field tests in adult rats (±s)

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2.3 八臂迷宮測試結果

2.3.1 對成年雄鼠的影響 成年雄鼠錯誤次數(shù)＞3的百分比由低到高依次為G2h-3d組、Naive組、G6h組、G2h-1d組，分別為21.4%、34.3%、50.0%、50.0%。與Naive組比較，G6h組和G2h-1d組錯誤次數(shù)＞3的百分比明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043、P=0.043)，而Naive組與G2h-3d組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.090)。各處理組間比較，G6h組、G2h-1d組錯誤次數(shù)＞3的百分比明顯高于G2h-3d組(P＜0.001，圖1A)。成年雄鼠重復錯誤次數(shù)各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1B)。各組成年雄鼠入臂總次數(shù)(以＞7的百分比表示)比較，G6h組明顯高于Naive組(P=0.042)，而G6h組和G2h-1d組明顯高于G2h-3d組(P=0.003、P=0.008，圖1C)。與其余3組比較，G2h-3d組入臂總耗時明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001、P＜0.001、P=0.030，圖1D)。提示發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年后雄鼠的空間認知能力有一定影響，單次長時間和間隔較短的異氟烷多次處理，對成年后雄鼠的長期記憶均有損害，而延長處理間隔時間可明顯減輕雄鼠空間認知能力的損害。

2.3.2 對成年雌鼠的影響 與Naive、G2h-1d和G2h-3d組比較，G6h組成年雌鼠錯誤次數(shù)＞3的百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008、0.024、0.008，圖2A)。G6h組成年雌鼠重復錯誤次數(shù)明顯低于Naive、G2h-1d和G2h-3d組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005、0.000、0.046)，且G2h-3d組明顯低于G2h-1d組(P=0.024，圖2B)。G6h組入臂總次數(shù)(以＞8的百分比表示)為6%，明顯低于Naive、G2h-1d和G2h-3d組(分別為32%、30%和26%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001、0.002、0.006，圖2C)。G6h組入臂總耗時也明顯低于Naive、G2h-1d和G2h-3d組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000、0.006、0.039，圖2D)。提示發(fā)育期單次異氟烷處理6h對雌鼠成年后的空間認知能力可能具有促進作用，但多次異氟烷處理對雌鼠成年后的臨時記憶有一定損害，延長處理間隔時間可減弱對成年后臨時記憶的影響。

2.3.3 不同性別成年大鼠八臂迷宮測試結果比較

Naive組中雌鼠錯誤次數(shù)＞3的百分比和入臂總次數(shù)＞7的百分比均明顯高于雄鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.031、0.000)，而G6h組中雌鼠則明顯低于雄鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016、0.041，圖3A、C)。G2h-1d組雌鼠重復錯誤次數(shù)明顯高于雄鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010，圖3B)。G2h-3d組雌鼠在錯誤次數(shù)＞3的百分比和入臂總次數(shù)(以＞7的百分比表示)均明顯高于雄鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000、0.000，圖3A、C)。Naive和G6h組雌鼠入臂總耗時明顯低于雄鼠(P=0.023、0.000，圖3D)。提示大鼠成年后，雄鼠的空間認知功能明顯優(yōu)于雌鼠；發(fā)育期單次異氟烷處理6h對雄鼠成年后的空間認知功能有一定損害，而多次異氟烷處理對雌鼠成年后的空間記憶損害作用更為明顯。

圖1 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年雄鼠八臂迷宮測試結果的影響Fig.1 Effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of radial arm maze test in adult male rats(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with Naive group; (3)P＜0.05, (4)P＜0.01 compared with G2h-3d group

圖2 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年雌鼠八臂迷宮測試結果的影響Fig. 2 Effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of radial arm maze test in adult female rats(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with Naive group; (3)P＜0.05, (4)P＜0.01 compared with G6h group; (5)P＜0.05 compared with G2h-1d group

圖3 發(fā)育期不同方式異氟烷麻醉對大鼠八臂迷宮影響的性別差異Fig. 3 Gender differences on the effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of radial arm maze test in adult rats

2.4 Morris水迷宮測試結果 各組雄鼠在目標象限、相反象限耗時比較差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.756、0.674)，潛伏期、穿梭平臺次數(shù)、平臺耗時和速度比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.687、0.945、0.814、0.980)，其中G2h-1d組與其他3組相比在相反象限中耗時最長、潛伏期最長、穿梭平臺次數(shù)最少、平臺耗時最短，但差異無統(tǒng)計學意義(表2)。各組雌鼠在目標象限耗時、潛伏期、平臺耗時、速度等指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；G2h-3d組在相反象限耗時低于G2h-1d組，穿梭平臺次數(shù)多于G2h-1d組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033、0.04，表3)。提示發(fā)育期多次異氟烷處理，延長處理間隔時間能夠明顯提高成年大鼠在水迷宮測試中的視覺相關空間認知功能。

3 討 論

近年來，全身麻醉及鎮(zhèn)靜藥物對于發(fā)育期大腦影響的研究備受關注，F(xiàn)DA的用藥警示[4]則引起了更為廣泛的擔憂，尤其是需要經(jīng)歷長時間或多次手術麻醉的嬰幼兒，其大腦發(fā)育及認知是否受到影響再次成為研究熱點。但該警示主要基于臨床前研究結果，針對人類的回顧性研究目前尚無明確結論[1]，基礎研究也因實驗動物種類，麻醉藥物處理時機、處理時間及次數(shù)，神經(jīng)損害的檢測指標，實驗動物行為學測試的方法，以及是否有手術傷害性刺激等原因，導致結果存在明顯差異[2]。其中達成共識的結論指出，相比發(fā)育期短時間麻醉藥物處理，長時間或多次處理對成年后神經(jīng)發(fā)育及認知存在一定影響[1]。本研究旨在探討延長發(fā)育期多次麻醉處理的間隔時間能否減輕對成年大鼠認知行為的影響，結果顯示，發(fā)育期多次異氟烷處理對大鼠成年后焦慮、探索等自主行為沒有明顯影響，但對空間記憶功能存在一定影響。

表2 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年雄鼠水迷宮測試結果的影響(±s，n=7)Tab. 2 Effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of Morris water maze test in adult male rats (±s, n=7)

表2 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年雄鼠水迷宮測試結果的影響(±s，n=7)Tab. 2 Effects of neonatal isoflurane exposures in different ways on the results of Morris water maze test in adult male rats (±s, n=7)

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表3 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年雌鼠水迷宮測試結果的影響(±s，n=5)Tab. 3 Eあects of neonatal iso fl urane exposures in diあerent ways on the results of Morris water maze test in adult female rats (±s, n=5)

表3 發(fā)育期不同方式異氟烷處理對成年雌鼠水迷宮測試結果的影響(±s，n=5)Tab. 3 Eあects of neonatal iso fl urane exposures in diあerent ways on the results of Morris water maze test in adult female rats (±s, n=5)

(1)P＜0.05 compared with G2h-31d group

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本研究在經(jīng)典的測試大鼠空間記憶行為的八臂迷宮和Morris水迷宮實驗中發(fā)現(xiàn)：間隔時間較短的多次異氟烷處理組(G2h-1d組)，無論雌性還是雄性大鼠，其成年后認知行為表現(xiàn)均較差，與既往研究一致[11-12]。延長異氟烷處理間隔時間后(G2h-3d組)，雄鼠的行為學表現(xiàn)優(yōu)于單次處理組和對照組，而單次異氟烷處理6h組的雌鼠成年后也表現(xiàn)出明顯的認知行為學優(yōu)勢。該結果提示，發(fā)育期異氟烷處理對大鼠成年后認知行為的影響存在明顯的性別差異，與Shen等[13]的研究結果一致。

針對人類的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，幼兒發(fā)育期接受多次全身麻醉可明顯增加學習障礙及注意缺陷障礙的發(fā)生率[14-16]。最近Hu等[17]對1057例接受單次或多次全身麻醉的兒童進行隊列研究，再次證實3歲以內幼兒單次麻醉經(jīng)歷與閱讀及語言測試成績下降相關，多次麻醉則影響認知能力和學習成績，增加學習障礙和注意力缺陷/多動癥的風險，但是否完全由麻醉藥物的影響所致尚無定論。目前通過嚙齒類及非人類靈長動物實驗證實，麻醉藥物導致的神經(jīng)毒性可引起短期或持續(xù)的神經(jīng)認知功能損害[2,18]，涉及的吸入麻醉藥包括氟烷、異氟烷和七氟烷，在大腦發(fā)育期可引起神經(jīng)元變性、凋亡，進而導致認知功能(空間學習及記憶)受損[19-20]。單次異氟烷處理發(fā)育期的嚙齒類動物后，免疫組化染色可見大腦神經(jīng)元突觸密度及線粒體密度降低、樹突棘減少、神經(jīng)元凋亡增加等神經(jīng)毒性現(xiàn)象[21-22]，但成年后未見明顯認知行為異常[22-23]。全麻藥物引起的發(fā)育期神經(jīng)變性凋亡并不一定引起成年后的神經(jīng)認知行為異常，考慮與發(fā)育期麻醉暴露時間、暴露次數(shù)等多種因素有關[24-25]。而有研究顯示，多次異氟烷處理發(fā)育期嚙齒類動物對其成年后的認知功能具有明顯損害[11]；七氟醚處理間隔時間越短，其引起的成年后認知損害越明顯[12]。本研究結果顯示，發(fā)育期異氟烷多次處理可導致大鼠成年后認知功能受損，而延長處理間隔時間可明顯減輕成年大鼠的認知損害，與既往研究[11-12]一致。該結果提示，對于臨床中需要多次手術麻醉的嬰幼兒，應盡可能延長手術麻醉的間隔時間，以減輕或消除成年后可能的認知損害，為臨床選擇手術時機提供了基礎研究的證據(jù)。

為避免雌激素的影響，基礎研究中多選用雄性動物進行實驗。也正因如此，雌性在臨床前研究中常被忽略。但不同性別動物的行為、神經(jīng)化學及神經(jīng)解剖學上的差異是不容忽視的[26]。發(fā)育期異氟烷多次處理對成年后大鼠認知行為影響的性別差異是本研究的另一重要內容，結果發(fā)現(xiàn)，與雄鼠相比，異氟烷持續(xù)處理6h的雌鼠成年后認知功能明顯增強，而間隔時間較短的多次異氟烷處理可使雌鼠成年后認知功能發(fā)生損害。無論是成年后認知功能增強還是受損，發(fā)育期異氟烷處理對雌鼠成年后認知功能的影響較大。該結果與Boscolo等[27]的報道一致，他們認為發(fā)育期雌鼠更易受到麻醉藥物(咪達唑侖+笑氣+異氟烷)的影響。目前越來越多的研究顯示，雌鼠的基礎反應水平明顯強于雄鼠，但在空間學習記憶方面弱于雄鼠[26]，本研究的行為學測試也證實了這一點。不同性別大鼠的神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)形成及可塑性、學習記憶、處理壓力等能力存在差異[26]；雌鼠對精神藥物的反應更為強烈，而空間記憶能力較差，也更易受損[26]。性別差異及雌激素在認知行為中的作用還有待進一步深入研究。

麻醉藥物對神經(jīng)功能的影響除了神經(jīng)毒性外，還有研究證實具有一定的神經(jīng)保護作用，尤其是對已有的神經(jīng)損害。Weeks等[28]報道應用異氟烷麻醉治療藥物難治性抑郁癥，發(fā)現(xiàn)異氟烷吸入麻醉處理后，患者神經(jīng)認知測試評分明顯改善，提示異氟烷具有一定的抗抑郁作用。Murphy等[11]的研究也證實，單次七氟烷處理2h后，雄鼠的空間記憶能力明顯提高。本研究中發(fā)育期單次異氟烷處理6h(G6h組)的雌鼠及異氟烷多次處理(G2h-3d組)的雄鼠，其成年后的認知功能明顯增強。De Roo等[29]報道，在大腦發(fā)育的關鍵時期，麻醉藥物能夠促進軀體感覺皮層和海馬突觸的發(fā)生，增加樹突棘密度，并促進功能性突觸的形成。但上述研究結果的生理學基礎及其作用機制尚有待進一步探索。

綜上所述，本研究結果表明，生后發(fā)育期不同時間間隔的異氟烷處理對大鼠成年后認知功能具有一定影響。間隔時間短的多次處理易造成認知損害，延長處理間隔時間能有效減輕或消除成年后的認知行為異常，且這種作用存在明顯的性別差異。本研究為臨床需要多次手術麻醉的患兒如何選擇手術時機，以盡可能降低對其成年后認知功能的影響提供了必要的臨床前研究證據(jù)。

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