普通油茶花粉的超低溫保存研究

（中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400 ）

油茶Camellia oleifera是山茶科Theaceae山茶屬Camellia常綠灌木或小喬木，是我國特有的木本油料樹種[1]。油茶籽榨出的茶油是一種高檔的食用油，有“東方橄欖油”和“油中軟黃金”的美譽(yù)，我國是世界上最大的茶油生產(chǎn)國。近年來，本課題組對油茶作了大量的基礎(chǔ)研究工作[2-3]，陸續(xù)有研究表明普通油茶大多表現(xiàn)自交不親和[4-5]，生產(chǎn)上需要配植授粉樹或采用人工授粉提高坐果率[6-7]。另外，種間雜交育種工作中，油茶花期不遇給育種工作者帶來很大困難。因此，研究油茶花粉保存對于促進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展意義重大。

植物花粉是種重要的種質(zhì)資源, 含有物種的全部遺傳信息, 具有豐富的遺傳多樣性, 為種質(zhì)交換和保存提供重要材料。近年來，油茶花粉性狀及授粉特性的研究報(bào)道廣泛[8-9]。油茶花粉在自然的條件下壽命短，低溫冷藏可以適當(dāng)延長壽命，但仍然不能滿足雜交育種的需要。超低溫保存是指將植物活體材料采用一定的技術(shù)措施，存入液氮中保存，需要時(shí)采用一定的方法使之回到常溫并且能正常生長的一套生物技術(shù)措施[10]。超低溫技術(shù)大大延長了花粉壽命，上世紀(jì)初，就有研究指出經(jīng)-180 ℃保存的金魚草花粉仍有活力，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，降低花粉的含水量能提高保存效果[11]。近年來，超低溫技術(shù)陸續(xù)實(shí)現(xiàn)了農(nóng)作物、果樹、蔬菜、園林植物等多種花粉的有效保存[12-18]，但普通油茶花粉超低溫保存研究一直未見報(bào)道。本試驗(yàn)以普通油茶3個品種無性系花粉作為試材，進(jìn)行超低溫保存研究，探討油茶花粉超低溫保存前的干燥脫水、預(yù)凍處理、從液氮取出后的解凍復(fù)蘇方式對超低溫保存效果的影響，為實(shí)現(xiàn)普通油茶花粉長期保存提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花粉采集及處理

花粉采集于2014年10月中旬（盛花期）在浙江省金華市瑯琊鎮(zhèn)東方紅國有林場油茶收集圃進(jìn)行。該收集圃于2006年春營造，圃內(nèi)油茶無性系樹體健壯，長勢良好，2008年正常開花結(jié)實(shí)。于晴天上午分別采集普通油茶無性系品種001、002、003號大蕾各500個以上放入自封袋，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。用清潔的鑷子從花蕾中取出花藥后平鋪到硫酸紙上，置于室溫?zé)艄庀??；ㄋ庨_裂散粉后，用50目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩過篩，收集花粉。每個無性系的花粉分裝3部分，一部分用1.5 mL離心管分裝，測定含水量及萌發(fā)率；一部分進(jìn)行干燥脫水處理并投放液氮，研究不同含水量的花粉超低溫保存效果；另一部分用硫酸紙包好放入10 mL指形管中，并將指形管放入硅膠干燥器里置于4 ℃冰箱中，觀測花粉低溫冷藏保存效果。

1.2 方 法

1.2.1 花粉活力測定

花粉萌發(fā)率測定采用離體萌發(fā)法[19]，培養(yǎng)基采用 0.01% 硼酸 +0.03% 硝酸鈣 +0.02% 硫酸鎂 +0.01%硝酸鉀 +15%蔗糖+1%瓊脂[20]，培養(yǎng)溫度為25 ℃。新鮮花粉培養(yǎng)4 h（預(yù)實(shí)驗(yàn)得出），超低溫保存后的花粉培養(yǎng)8 h（預(yù)實(shí)驗(yàn)得出），分別鏡檢，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管長度超過花粉粒直徑作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察4個視野，每個視野統(tǒng)計(jì)花粉粒不少于50粒，取12個視野萌發(fā)率的均值作為該處理下花粉的萌發(fā)率，以花粉萌發(fā)率作為花粉生活力指標(biāo)。

萌發(fā)率＝觀察視野內(nèi)發(fā)芽花粉粒數(shù)／視野內(nèi)花粉?？倲?shù) ×100%

相對保持率＝（液氮保存后花粉萌發(fā)率／液氮保存前花粉萌發(fā)率）×100%

1.2.2 預(yù)凍及解凍處理

預(yù)凍：將花粉脫水干燥后分別置于-26 ℃預(yù)凍1 h、4℃預(yù)凍1h、4℃（1 h）→-20℃（1 h）→-80℃（1 h）變溫預(yù)凍、以及室溫條件下不預(yù)凍，然后投入液氮保存，30 d后測定萌發(fā)率。

解凍：將花粉從液氮中取出，分別置于室溫（11 ℃）解凍（30 min）、38 ℃溫水浴快速解凍（3 min）、4 ℃恒溫解凍（30 min）以及-80 ℃（1 h）→ -20 ℃（1 h）→ 4 ℃（1 h）逐級升溫進(jìn)行復(fù)蘇，40 d后測定萌發(fā)率。

1.2.3 花粉脫水及含水量測定

將花粉放入30℃的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行干燥脫水處理，獲得不同含水量的花粉?；ǚ酆繙y定采用烘干法[18]，烘干溫度為120 ℃，每次烘1 h，反復(fù) 5～8次，直至恒質(zhì)量，每個處理設(shè)置3個重復(fù)?；ǚ酆浚剑ɑǚ埘r質(zhì)量－花粉干質(zhì)量）／花粉鮮質(zhì)量 ×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫（4℃）干燥保存油茶花粉壽命

將收集到的新鮮花粉用硫酸紙包好，放入硅膠干燥器中，再將盛有硅膠的干燥器置于4 ℃冰箱，定期測定花粉萌發(fā)率（見圖1）。3種花粉活力變化趨勢基本一致，隨著保存時(shí)間的延長，花粉活力迅速降低。新鮮花粉含水量較高，保存10 d后，活力均有大幅度降低，保存30 d后花粉活力有所回升，此時(shí)花粉萌發(fā)率均維持40%以上；保存至90 d時(shí)，花粉發(fā)白，活力均低于30%，此后花粉萌發(fā)率更低；保存一年時(shí)間，活力完全喪失。據(jù)此，為保證雜交育種花粉質(zhì)量，建議短期內(nèi)可選擇低溫干燥保存花粉，但保存期限不宜超過一個月。

圖1 油茶花粉在4 ℃干燥條件下活力變化Fig.1 Pollen germination rate under 4 ℃ condition

2.2 含水量對花粉保存的影響

大量研究表明，超低溫保存前的適度脫水處理是保持花粉活力的關(guān)鍵。據(jù)表1，脫水干燥處理對普通油茶無性系3個品種花粉的超低溫保存有類似影響。未脫水的花粉含水量均超過30%，超低溫保存后，活力很低。經(jīng)脫水處理，花粉含水量不斷降低，花粉活力也不斷下降，液氮保存后的花粉萌發(fā)率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。001號花粉干燥脫水3～4 h，含水量為13.91%～14.43%時(shí)，超低溫保存后活力最高；002號花粉脫水2～5 h至含水量為11.65%～14.29%時(shí)，液氮保存后活力最高達(dá)41.01%～44.09%；003號脫水3～5 h，花粉含水量為14.46%～15.70%時(shí)，超低溫保存效果最好。因此，投放液氮前花粉的脫水處理對于保持其活力至關(guān)重要。

表1 含水量對油茶花粉超低溫保存效果的影響Table 1 Effect of water content on germination rate of frozen Camellia pollen

2.3 預(yù)凍對花粉保存的影響

花粉脫水后分別經(jīng)-26℃預(yù)凍1 h、4℃預(yù)凍1 h、4℃（1 h）→ -20 ℃（1 h）→ -80 ℃（1 h）逐級降溫預(yù)凍、以及室溫（11 ℃）不預(yù)凍等4種處理，投放液氮中保存30 d，在38 ℃水?。? min）解凍后，花粉萌發(fā)率見表2。-26 ℃預(yù)凍（1 h）處理過的3個油茶品種花粉萌發(fā)率均顯著高于其他處理（P＜0.05）；逐級降溫預(yù)凍效果次之；室溫不預(yù)凍處理下花粉超低溫保存效果最差。因此，-26 ℃（1 h）預(yù)凍處理對于3個油茶無性系品種花粉超低溫保存最有效。

表2 預(yù)凍方式對油茶花粉超低溫保存效果的影響Table 2 Effect of pre-freezing on pollen germination rate after LN2 storage %

2.4 解凍對花粉保存的影響

以液氮保存40 d的3個油茶無性系品種花粉作為試驗(yàn)材料，研究解凍方式對超低溫保存效果的影響（表3）。表3可知，解凍方式對3個品種花粉超低溫保存效果的影響較為一致。經(jīng)38 ℃溫水浴快速解凍（3 min），超低溫保存的3種花粉萌發(fā)率均最高。-80 ℃（1 h）→ -20 ℃（1 h）→4 ℃（1 h）逐步升溫解凍，對于001號花粉保存效果不及水浴解凍處理，對002、003號花粉超低溫保存效果較好。逐級升溫解凍處理下，002、003號花粉萌發(fā)率與水浴解凍處理差異不顯著，但顯著高于另外兩個解凍處理。3種花粉在4 ℃緩慢解凍下，萌發(fā)率均最低。綜上所述，38 ℃溫水浴快速解凍（3 min）對于油茶花粉超低溫保存效果最好。

2.5 超低溫保存不同時(shí)間花粉活力變化

對液氮保存半年、一年時(shí)間的3個品種油茶花粉進(jìn)行離體萌發(fā)試驗(yàn)，分別測定發(fā)芽率（表4）。據(jù)表4可知，3種花粉超低溫保存總體效果較好。其中，002、003號花粉經(jīng)超低溫保存半年、一年時(shí)間，花粉仍保持很高活力，與貯藏前花粉活力差異不顯著（P＞0.05），003號花粉超低溫保存一年后活力較保存前有所提高；001號超低溫保存后較初始花粉活力有顯著降低（P＜0.05），這可能與花粉含水率較高有關(guān)，但保存時(shí)間對其萌發(fā)率也沒有顯著影響。3個品種油茶花粉在低溫干燥條件下短期內(nèi)保存效果較好，3個月后發(fā)芽率均低于30%，1年后活力全部喪失。因此，低溫干燥仍難以滿足雜交育種工作的需要。超低溫保存大大延長了花粉壽命，超低溫保存1年，油茶花粉仍保持90%以上的活力。由此可知，超低溫技術(shù)能較好地應(yīng)用于普通油茶花粉的周年保存。

表3 解凍方式對油茶花粉超低溫保存效果的影響Table 3 Effect of different thawing methods on pollen germination rate after LN2 storage

表4 超低溫保存一年油茶花粉活力變化Table 4 Pollen viability under cryopreservation after one year %

3 結(jié)論與討論

山茶屬花粉超低溫保存已有成功報(bào)道[18-19]，本研究以普通油茶3個無性系品種花粉作為試驗(yàn)材料，旨在擴(kuò)大油茶種質(zhì)資源超低溫保存及應(yīng)用范圍，解決油茶育種中花期不遇的困難。試驗(yàn)表明，花粉含水量是影響其超低溫保存效果的關(guān)鍵因素，花粉投放液氮前的脫水處理至關(guān)重要。3個品種花粉經(jīng)過30 ℃烘箱，干燥脫水2～5 h，花粉含水量達(dá)11.65%～15.70%時(shí)，超低溫保存效果最佳。超低溫保存前的預(yù)凍處理、花粉從液氮中取出后的解凍復(fù)蘇處理對花粉活力都有顯著影響。-26 ℃預(yù)凍（1 h）顯現(xiàn)出很好的預(yù)凍效果，這與本課題組對山茶屬花藥超低溫保存研究結(jié)果一致[19]；4 ℃預(yù)凍（1 h）及不預(yù)凍，花粉超低溫保存后活力大大降低，這與花粉體內(nèi)自由水含量過多、花粉細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、造成的細(xì)胞破裂有關(guān)[22]。解凍處理中，38 ℃（3 min）水浴快速解凍效果最好，逐級解凍次之，這與前人的研究結(jié)果類似。另外，低溫干燥保存油茶花粉，短期內(nèi)保存效果較好，可以滿足30 d內(nèi)花粉保存的需要，隨著保存時(shí)間的延長，花粉活力下降迅速，不能滿足種質(zhì)資源保存及長期雜交育種工作的需要。超低溫技術(shù)能實(shí)現(xiàn)普通油茶花粉的周年保存，3種花粉經(jīng)超低溫保存一年仍保持90%以上的活力。

本試驗(yàn)中，003號油茶花粉在超低溫保存一年后出現(xiàn)花粉萌發(fā)率較保存前略有升高的“冷刺激”現(xiàn)象。張玉進(jìn)[12]對魔芋 Amorphophallus konjac “Wanyuan” 花 粉 、Van Der Walt[23]對 山龍眼屬 Helicia花粉以及李秉玲[24]對芍藥Paeonia lactif l ora 花粉超低溫保存研究過程中都發(fā)現(xiàn)了這種“冷刺激”現(xiàn)象。張亞利[25]在梅花 Prunus mume花粉的超低溫保存中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，并探討了花粉細(xì)胞鈣離子的濃度變化，但該現(xiàn)象的機(jī)理目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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