實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)肉制品中牛/羊/豬源性成分

劉敏 黃小凱 胡秀紅

肉類源性成分鑒定的方法多種多樣，國內(nèi)外在基因水平上對(duì)肉類源性成分進(jìn)行鑒定的方法也越來越多。但是定性方法只能證明樣品中含有某種源性的肉類而不能證明不含有其他種類的肉類。而且對(duì)于肉類摻雜的比例的確定，在標(biāo)準(zhǔn)上還是一片空白。因此，建立一個(gè)方法去甄別肉類食品的輕微污染與故意摻假顯得十分重要。本文主要對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)肉制品中牛/羊/豬源性成分的方法進(jìn)行研究。

試驗(yàn)部分

試劑耗材。DNA提取試劑盒。

Taq PCR Master MIX。

DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

DNA引物和探針。

儀器設(shè)備。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

樣品DNA提取。通過從提取效果、提取時(shí)間、提取成本等各個(gè)方面考慮，最終選擇了試劑盒法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線。動(dòng)物源性和牛/羊/豬源性：每個(gè)run設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線5個(gè)反應(yīng)、陰性控制1個(gè)反應(yīng)、陽性控制2個(gè)反應(yīng)，每個(gè)樣本DNA至少2個(gè)反應(yīng)。

DNA標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)為1，000，000，通過用Buffer EB進(jìn)行稀釋，稀釋至濃度分別為100，000、10，000、1，000、100、10copies/μl。

每個(gè)校正點(diǎn)用2μl的標(biāo)準(zhǔn)DNA。將每個(gè)反應(yīng)的拷貝數(shù)量都記錄在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的分析軟件中，根據(jù)檢測(cè)到的熒光得到Ct值，從而得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

PCR體系。PCR擴(kuò)增體系中包含Taq PCR Master MIX 12μL，模板DNA2μL，上下游引物2μL，探針 1μL，加水至25μL。在該體系下，PCR擴(kuò)增曲線明顯，能達(dá)到定量的要求。

PCR程序。本實(shí)驗(yàn)室采用羅氏LC96，以下所列的PCR程序效果比較好。預(yù)變性90s，95℃，變性5sec， 95℃，退火10sec， 62℃，延伸15sec， 65℃，循環(huán)數(shù)為45。熒光通道的選擇FAM，在延伸階段收集熒光。

結(jié)果與討論

線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)。通過實(shí)驗(yàn)獲得結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，三種化合物在20～200000拷貝數(shù)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.97。其中各種源性線性如下：

檢出限、精密度和回收率。20和200，000起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)增曲線明顯，陰性對(duì)照無明顯擴(kuò)增曲線，儀器的檢出限可以達(dá)到0.01%。結(jié)合實(shí)際樣品及DNA提取等因素，本方法的檢出限可以達(dá)到1%。

按照重量配比，在不含目標(biāo)源性混合肉中分別摻入1%（w/w）、10%（w/w）和50%（w/w）的目標(biāo)源性肉類，再取一個(gè)純?nèi)鈽悠?，分別進(jìn)行6個(gè)平行的測(cè)定，獲得6個(gè)平行的實(shí)測(cè)數(shù)值。

通過計(jì)算檢出限為1%，精密度小于10%和回收率在85%- 110%之間。

本方法建立了牛/羊/豬源性成分的定量曲線，實(shí)現(xiàn)了肉制品中牛/羊/豬源性的相對(duì)定量，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟和方法，使得檢測(cè)時(shí)間短、精度較高、穩(wěn)定性較好。該方法也為制定相關(guān)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

基金項(xiàng)目：溫州市科技局立項(xiàng)項(xiàng)目（基金編號(hào)為S20150025）