即食海產品中納他霉素的測定方法研究

廖建萌 黃國方 曾丹丹

納他霉素（ N a t a m y c i n ）的化學式為C33H47NO13，分子量為665.73 ，熔點：280℃，是一種多烯大環(huán)內酯類化合物，為白色至乳白色的無臭無味的結晶粉末，微溶于水和甲醇，難溶于非極性有機溶劑；納他霉素屬于兩性化合物，在酸性或者堿性溶液中溶解度增加，但穩(wěn)定性會降低。納他霉素阻遏麥角甾醇的生物合成，達到抑制真菌的作用，對細菌和病毒不具有抗菌活性。

納他霉素可用于治療真菌引起的疾病，在食品工業(yè)中作為防腐劑使用，具有無臭、無味，低劑量且安全性高的特點，并且不影響奶酪、生火腿的自然成熟過程。在乳制品中添加納他霉素5～10mg/kg的量可以延長產品的貨架期；肉類食品噴涂4μg/ cm2的納他霉素即可達到有效的抑菌水平；添加納他霉素可防止水果飲料的變質；納他霉素還用于焙烤食品的防腐、水果蔬菜的采后貯藏等。納他霉素無毒，不致癌、不致敏，但是很難從動物或人體的胃腸吸收。

納他霉素的抗菌作用和安全性得到了廣泛認可，目前全世界有30多個國家允許納他霉素用于食品的生產和保藏，但是對其在食品中使用的法規(guī)標準不同。歐盟法規(guī)規(guī)定，納他霉素僅能應用于奶酪和香腸的表面防腐處理，禁止在葡萄酒中添加納他霉素； 美國聯(lián)邦法規(guī)規(guī)定，納他霉素可用于奶酪表面防腐處理，還可以添加到預混飼料中；我國GB2760《食品添加劑衛(wèi)生標準》中對納他霉素的使用也作出了具體規(guī)定，值得注意的是，即食類海產制品未在允許添加納他霉素的范圍內，意味著納他霉素在即食海產品中不得檢出。

根據(jù)報道納他霉素的測定方法主要有生物法、光譜法，色譜法，質譜法等方法，生物法操作過程也比較繁瑣，耗時長；分光光度法靈敏度不夠，測定即食海產品干擾大；質譜法儀器成本高，檢測即食海產品有基質效應；色譜法具有準確、高效、快速的特點。本論文研究高效液相色譜法測定即食海產品中納他霉素的含量的方法，為即食海產品中納他霉素的檢測提供技術參數(shù)。

材料與方法

儀器及材料。高效液相色譜儀：LC20A（日本島津公司）；色譜柱：VP- ODS柱（250 mm×4.6μm，日本島津公司）；電子分析天平（德國Sartorius 公司）；超聲波提取器（上海比朗）；渦旋混合器（德國IKA公司）；超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）；離心機（sigma公司）。

納他霉素標準品純度均大于98%（德國Dr.Erenstorfer公司）；甲醇（色譜純，美國CNW公司）；甲酸、氨水（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

儀器條件。流動相：甲醇：水（70：30，v/ v），等度洗脫。

流速：1.0mL/min；

色譜柱溫度：35℃；

檢測器：二極管陣列檢測器，波長305nm；

進樣量：20μL。

結果與討論

溶劑的選擇。分別用2.0%甲酸甲醇溶液、純甲醇溶液和2.0%氨水甲醇溶液將納他霉素配制成濃度分別0.5mg/L、5.0mg/L和50.0mg/L，上機測定三次，峰面積取平均值，結果見表1.

從表1中，看出純甲醇作為溶劑測定的峰面積結果最高，納他霉素濃度為0.5mg/L在不同的溶劑中峰面積差別較大，說明納他霉素在酸性或堿性溶液中穩(wěn)定性差，濃度越小，穩(wěn)定性越差，從實驗的結果看，純甲醇適合作為納他霉素的溶劑。

流動相的優(yōu)化。選擇甲醇-水體系作為測定納他霉素的流動相，流速為1.0mL/min，從5.0%甲醇水溶液開始，甲醇的比例以5%遞增進行測試，將5.0mg/L濃度的納他霉素標準溶液進樣20μL，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的增加，納他霉素保留時間減少，峰展寬變窄，峰面積的變化見圖1。

從圖1中，當流動相中甲醇的比例低于50%時，相同濃度下納他霉素的響應值降低，可能的原因是，一方面由于色譜峰有前伸和拖尾的現(xiàn)象較嚴重，部分納他霉素提前或者滯后流出，未能有效積分；另一方面甲醇比例的減少，納他霉素在溶液體系中部分析出，殘留在儀器管路內。當流動相中甲醇的比例高于50%時，相同濃度下納他霉素的響應值較高但是變化不大，如果用50%甲醇作為流動相，出峰時間較長，不利于提高工作效率，而用純甲醇作為流動相，出峰時間過快使得目標峰與其他雜質出峰時間相近，與雜質的分離度降低，所以選擇70%甲醇作為流動相既保證了分析的效率，又保障了合適的分離效果。

樣品前處理。

（1）提取試劑

選用50%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液，純甲醇進行提取納他霉素的試劑，在即食海產品樣品中添加納他霉素標準溶液，以回收率作為指標，添加濃度為5.0mg/L，結果見表2。

表中，三種試劑提取的納他霉素回收率在89%以上，50%甲醇水溶液提取的回收率相對偏低，70%甲醇水溶液和純甲醇都適合作為即食海產品中納他霉素的提取試劑，但是考慮到即食海產品中往往含有大量的脂肪色素等物質，純甲醇會將這些雜質更充分的提取，給儀器及色譜柱帶來更嚴重的污染，同時還浪費試劑，所以選擇70%甲醇水溶液作為即食海產品中納他霉素的提取試劑，既滿足了分析的要求，并且與流動相保持了一致，減少了試劑體系的系統(tǒng)峰。

（2）提取方式

選用70%甲醇水溶液，用不同的提取方式提取即食海產品中的納他霉素。取即食海產品樣品粉碎，稱樣5.0g，加入20mL70%甲醇水溶液，超聲波提取：用超聲波提取器提取30min，冷卻到室溫，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過0. 22 μm 濾膜，上機測定；浸泡提取：在室溫下放置10小時，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過0. 22 μm 濾膜，上機測定；震蕩提?。赫鹗?0min，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過0. 22 μm 濾膜，上機測定；結果見表3。表中表明三種方法提取的結果差別不大，但是超聲波提取用時少，更能提高工作效率。

方法學驗證。

（1）線性關系及檢出限

配制納他霉素的系列標準溶液濃度分別為1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L和20.0mg/L，上機測定，標準曲線圖見圖2。表明高效液相色譜法測定納他霉素在1- 20mg/ L的范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9995，以基線噪聲的三倍作為測定的檢出限，納他霉素的檢出限為0.2mg /L。

（2）精密度及回收率

進樣5.0mg/L納他霉素標準溶液，連續(xù)進樣11次計算精密度，結果見表4，高效液相色譜法測定納他霉素的精密度為1.49%，精密度符合測定的要求。

取陰性樣品，稱樣5.0g，分別添加成納他霉素含量為1.0mg/kg、5.0mg/kg和20.0mg/kg的測試樣品，加入20mL70%甲醇水溶液，超聲波提取30min，離心10分鐘，取上層溶液過0. 22 μm 濾膜，上機測定，回收率實驗結果見表5。高效液相色譜法測定納他霉素的回收率在90%以上，滿足分析要求。

結論

建立了高效液相色譜法測定即食海產品中納他霉素含量的方法，通過比較溶劑酸化甲醇、氨化甲醇和純甲醇，發(fā)現(xiàn)純甲醇比較適合作為納他霉素的溶劑；優(yōu)化了流動相，用70%甲醇水溶液作流動相分析納他霉素高效，分離度好；研究了前處理的提取試劑及提取方式，70%甲醇水溶液提取即食海產品中的納他霉素得到較好的結果，提取的方式選擇超聲波提取法；對方法進行驗證，高效液相色譜法測定即食海產品中納他霉素的含量的在1.0- 20mg/ L范圍線性良好，相關系數(shù)為0.9995，檢出限為0.2mg/L，精密度為1.49%，用該方法測定即食海產品中納他霉素含量的回收率在90%以上。高效液相色譜法測定即食海產品中納他霉素含量的方法快速，準確，高效，可滿足檢測技術要求。