豬脂肪沉積和胚胎附植期FTO基因的表達及堿基突變檢測

付言峰， 李 蘭， Robert V. Knox， 李碧俠， 方曉敏， 任守文

(1.江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室/江蘇省農業(yè)種質資源保護與利用平臺， 江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農業(yè)科學院動物免疫工程研究所， 江蘇 南京 100193; 3.美國伊利諾伊大學， 伊利諾伊 厄巴納-香檳 61801)

近些年來，隨著人們對豬肉品質的要求越來越高，肉質性狀也越來越被養(yǎng)豬企業(yè)所關注[1-2]，而影響豬肉質性狀(眼肌面積、背膘后、瘦肉率、肌間脂肪含量 等)的一個關鍵因素是脂肪沉積[3]，脂肪沉積非常復雜，每一種類型的脂肪沉積都對應一種不同的沉積過程[4-5]。另外，豬產仔數(shù)是一個重要的繁殖性狀和經濟性狀[6]，而影響豬產仔數(shù)的一個關鍵因素是胚胎附植[7]，因為很多胚胎在這個過程中死亡[8]，而這些胚胎的死亡是導致產仔數(shù)下降的一個重要原因[9-11]。此外，豬作為一個良好的新型模式動物，在研究人類疾病(如肥胖和流產)的過程中也發(fā)揮著重要的作用[12]。

作為一個同時影響豬肉質性狀和繁殖性狀的基因，脂肪肥胖相關基因 (FTO)于2007年被發(fā)現(xiàn)與肥胖相關[13]，在人類和小鼠上的研究結果表明該基因在控制食欲和能量消耗方面具有重要作用[14-15]。FTO基因可以通過調控脂肪細胞成脂功能，從而調節(jié)人類肥胖的發(fā)生[16]。國外對豬FTO基因的遺傳變異與其肌內脂肪、肌間脂肪的沉積、大理石評分、滴水損失及瘦肉率等豬肉品質的關系研究已有零星報道[17]，國內對豬FTO基因的遺傳變異在不同品種豬群中的多態(tài)性分布也有一些報道[18]。

除了影響脂肪代謝以外，F(xiàn)TO還影響機體的繁殖性能[19]。人和大鼠中的研究結果表明，胎盤組織中的FTO基因在子宮內環(huán)境與胎兒生長發(fā)育之間發(fā)揮了橋梁作用[20]；在小鼠中，原位雜交和Real-time qPCR結果表明，F(xiàn)TO在胚胎組織中表達量很高[12]；在山羊中，研究發(fā)現(xiàn)妊娠第110 d時，胎盤組織中的FTO表達與胎兒體質量有很強的相關性[21]；在荷斯坦牛中，F(xiàn)TO多態(tài)性影響乳脂量[22]。

鑒于FTO在脂肪代謝和繁殖過程中的生物學功能，本研究采用Real-time qPCR方法分析了FTO在脂肪沉積過程中的蘇山豬組織樣中的表達，F(xiàn)TO在胚胎附植過程中的梅山豬組織樣中的表達，克隆測序了蘇山豬FTO基因的全長編碼序列(CDS)，并推測了編碼序列上SNPs突變所引發(fā)的氨基酸變化。這些結果將有助于人們進一步了解FTO的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

脂肪沉積研究所用試驗動物來自江蘇洪澤鑫象豬業(yè)有限公司，選用10頭體質量達(95±2) kg、6月齡的半同胞健康蘇山豬，分成2組，即：5頭高脂豬(活體測定背膘厚度最高的前5頭豬)和5頭低脂豬(活體測定背膘厚度最低的后5頭豬)，這些試驗豬在同一豬場進行統(tǒng)一的飼喂和管理，同時在自由采食及飲水條件下，進行疾病防治和行為體況觀察。將供試豬電昏后在同一天快速屠宰，然后用無RNase的手術器械參照屠宰程序[23]采集蘇山豬的16種組織樣(背膘、背最長肌、心、肝、脾、肺、胃、大腸、小腸、腎、膀胱、卵巢、輸卵管、子宮體、子宮頸和子宮內膜)。上述組織樣采集后，立即用液氮冷凍保存，用于后續(xù)的RNA提取。

胚胎附植研究的試驗動物來自于江蘇農林職業(yè)技術學院梅山豬保種場，以3頭梅山豬母豬(第5胎次～第7胎次)為研究對象，按豬場常規(guī)條件進行飼喂和管理，同時在自由采食及飲水條件下，進行疾病防治和行為體況觀察。在同場、相同管理條件下進行單圈飼養(yǎng)，進行同期發(fā)情處理，相同種公豬精液授精妊娠。以最后一次配種為0 d計，在配種第18 d(附植中期)進行屠宰，采集全身20種組織樣(子宮體、胚胎、子宮內膜附著點、子宮內膜非附著點、卵巢、子宮角、大腦、下丘腦、垂體、脊髓、心、肝、脾、肺、胃、大腸、小腸、腎上腺、腎和膀胱)。 樣品采集后，立即用液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有TRIzol (Invitrogen, America)、AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (BBI, Canada)、SybrGreen PCR Master Mix 2X (ABI, America)、瓊脂糖 (Biowest, Spain)、DEPC (KeyGen, China)、PremixTaq(TaKaRa, Japan)，1×TAE等緩沖液為自配，其他常規(guī)試劑為南京化學試劑有限公司生產。

熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(ABI, America)、凝膠成像儀 (Tanon 3500, China)、紫外分光光度儀(Shimadzu，Japan) 、超純水儀(Millipore, USA)、自動滅菌鍋(博訊 YXQ-LS-50A, China) 、高速冷凍離心機(Eppendorf, Germany)。

1.3 引物設計

豬FTO(GenBank: NM_001112692)和GAPDH(持家基因)的Real-time quantitative PCR引物均由Primer Premier 5.0軟件設計，其中FTO_fat deposition引物用于脂肪沉積的研究，F(xiàn)TO_embryo implantation引物用于胚胎附植的研究。引物(表1)由上海英濰捷基(Invitrogen)生物公司合成。

表1 豬FTO基因實時熒光定量PCR分析用引物序列及反應條件

1.4 RNA提取與反轉錄成cDNA

總RNA用TRIzol/氯仿方法[24]從豬組織樣品中提取，之后用超微量紫外分光光度計 (Thermo NANODROP 2000 Spectrophotometer, 美國) 檢測提取RNA濃度，再用1.5%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。

RT-PCR中的RT(反轉錄),使用總RNA為模板合成cDNA第一鏈，采用“AMV First Strand cDNA Synthesis Kit”試劑盒，21 μl反轉錄反應體系，分兩步進行， (1)Total RNA 5 μl, Rnase-free ddH2O 5 μl，隨機引物(10 pmol/μl)各1 μl，70 ℃溫浴5 min。(2) 冰浴10 s，離心加入下列試劑：5×Reaction Buffer 4 μl, dNTP Mix (10 mmol/L) 2 μl, Rnase inhibitor (20 U/μl) 1 μl, AMV Reverse Transcriptase (10 U/μl) 2 μl。(3) 37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，70 ℃溫浴10 min。終止反應。-20 ℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR

為了保證樣品的可靠性，對反轉錄生成的cDNA先進行預試驗。為減少干擾，每個cDNA樣本都稀釋10倍 (5 μl cDNA + 45 μl H2O)，每個樣品做3個重復，并用ddH2O 代替cDNA 模板做陰性對照，以檢測是否有外源DNA污染。

以cDNA為模板，分別定量PCR擴增基因目的片段，20 μl PCR反應體系如下：SybrGreen qPCR Master Mix (2X) 10.0 μl, 上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，模板(cDNA稀釋10倍) 1.0 μl,TaqDNA Polymerase 0.3 μl, 加Rnase-free ddH2O到 20.0 μl。反應程序如下：95 ℃ 2 min 熱啟動HotStarTaq酶活性；95 ℃溶解10 s，60 ℃煺火/延伸 40 s，循環(huán)40次；45～95 ℃，讀板時0.1 ℃/s進行溶解曲線分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)利用2-△△Ct法分析，得到FTO的mRNA 相對表達量，內參基因為GAPDH[25-26]。不同組織間mRNA表達量的差異性顯著水平通過SAS 8.2 統(tǒng)計軟件包進行GLM分析，結果以最小二乘均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果

組織樣中提取的總RNA利用分光光度計測定出的OD260/OD280結果大都處于1.8～2.1，表明提取的RNA濃度和質量都較高。隨機選取8種組織樣提取的總RNA，進行瓊脂糖電泳檢測，結果顯示總RNA在凝膠上顯示出2條清晰的條帶，分別為28 S和18 S rRNA，且同一組織樣的2條帶的灰度值比值(28 S/18 S)大都處于1.0～1.5，表明總RNA基本完整，可以滿足后續(xù)的反轉錄和Real-time PCR試驗的要求(圖1)。

2.2 FTO在豬脂肪沉積過程中的mRNA表達

半定量PCR結果表明，F(xiàn)TO的mRNA在蘇山豬的11種組織樣中均有表達，其mRNA相對表達量(兩條帶灰度值比值FTO/GAPDH)由大到小排序為：卵巢(0.91)、 肺(0.89)、輸卵管(0.86)、 子宮內膜 (0.83)、大腸(0.66)、子宮體(0.65)、 子宮頸 (0.64)、脾(0.57)、 膀胱(0.50)、胃(0.42)和小腸(0.04)。其中，卵巢、輸卵管、子宮內膜等繁殖組織樣中的表達量高于其他組織樣 (圖2)。

從左至右依次為：脊髓、大腦、小腸、大腸、膀胱、心、背最長肌和脾臟。圖1 不同組織樣提取的總RNA的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.1 Results of 1.5% agarose gel electrophoresis for total RNA extracted from different swine tissues

圖2 FTO基因在蘇山豬不同組織中的mRNA表達量Fig.2 The mRNA expression level of FTO in different tissues of Sushan pigs

定量PCR(Real-time qPCR)結果表明，F(xiàn)TO的mRNA在蘇山豬的另外5種組織樣中也均有表達，包括：背膘、心、腎、背最長肌和肝。按照mRNA表達量由大到小排序，低脂豬為：背膘(9.44)、心臟 (1.00)、腎臟 (0.92)、肝臟 (0.20)、背最長肌 (0.08)；高脂豬為：背膘 (10.59)、心臟 (0.85)、背最長肌 (0.81)、肝臟 (0.58)、腎臟 (0.51)。對2種脂肪類型豬綜合分析，背膘中的mRNA表達量最高，且極顯著高于其他任何組織(P< 0.01)；背最長肌中的mRNA表達量，高脂豬顯著大于低脂豬(P<0.05)(圖3)。FTO的表達量越高，脂肪含量越高，眼肌面積和瘦肉率越低(表2)，F(xiàn)TO的高表達似乎促進豬的脂肪沉積。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 FTO基因在蘇山豬不同組織樣中的定量PCR結果Fig.3 Quantitative PCR results of FTO in different tissues of Sushan pigs

2.3 FTO在豬胚胎附植過程中的mRNA表達

Real-time quantitative PCR結果顯示，胚胎附植中期 (妊娠第18 d)，在梅山豬15種組織樣中均檢測到FTO基因的mRNA表達，按表達量從高到低，依次為：子宮體、胚胎、下丘腦、子宮內膜附植點、子宮內膜非附植點、卵巢、子宮角、大腦、膀胱、脊髓、腎上腺、脾、垂體、背膘和心。在這些組織樣中，子宮體、胚胎、子宮內膜附植點、非附植點和卵巢等繁殖組織樣中mRNA的表達量顯著高于其他組織樣(下丘腦除外) (P<0.05)，這說明胚胎附植期繁殖組織樣是FTO的主要靶組織。

另外，F(xiàn)TO在下丘腦組織中的表達量排名第三，在垂體中也有較高的表達量 (圖4)，表明,FTOmRNA的表達在胚胎附植調控中發(fā)揮一定作用，調控途徑很可能是下丘腦-垂體-性腺軸。另外，F(xiàn)TO在豬脂肪沉積過程和胚胎附植過程中所展現(xiàn)出的不同的表達趨勢，表明其作用廣泛，在機體生長發(fā)育、妊娠維持等方面均發(fā)揮著重要作用。

表2 用于FTO表達研究的蘇山豬的脂肪沉積相關肉質性狀

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。

圖4 胚胎附植期FTO基因在梅山豬不同組織樣中的mRNA表達Fig.4 The mRNA expression of FTO in different tissues of Meishan pigs during embryo implantation

2.4 FTO的單核苷酸突變(cSNPs)及引起的氨基酸突變

本研究使用克隆測序法，在51頭蘇山豬群中檢測了FTO編碼序列(即CDS區(qū)，范圍：15～1 532 bp)上的單核苷酸突變(cSNPs)，并對這些突變引起的氨基酸水平的突變進行了分析。結果表明，蘇山豬FTO編碼序列(GenBank: JX873956)上共發(fā)現(xiàn)10個cSNPs，依次為：G52A(FTOcDNA序列第52位的G→A突變)、A227G、C523T、C608G、G628A、A655G、A810G、A886G、G1002A和A1344G。這10個cSNPs分布于第1、第3、第4、第6、第8外顯子上，其中有8個突變引起了所編碼氨基酸的變化(表3)。

表3 蘇山豬群中檢測到的FTO基因cSNPs及其引起的氨基酸突變

2.5 FTO第3外顯子cSNPs的基因和基因型頻率

通過直接測序法，本研究檢測了51頭蘇山豬群中的FTO第3外顯子中的4個cSNPs (A227G、C523T、C608G和G628A)。結果(表4)表明，在A227G和G628A位點均檢測到3種基因型，而在C523T和C608G位點均只檢測到2種基因型。卡方 (χ2)檢驗結果表明，A227G、C523T和G628A位點的基因和基因型頻率均處于哈代-溫伯格平衡分布，而C608G位點則處于哈代-溫伯格不平衡分布 (P<0.01)。

表4 蘇山豬群中檢測到的FTO基因cSNPs位點的基因頻率和基因型頻率

χ2(df=2)0.01=9.21,χ2(df=2)0.05=5.99;**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

脂肪沉積可以影響豬背膘厚、背最長肌橫截面積、瘦肉率等肉質性狀[3]。胚胎附植可以影響豬窩產仔數(shù)、終生產仔數(shù)、母豬利用年限等繁殖性狀[27-28]。隨著定位克隆、物理作圖和候選基因等分子生物學技術的發(fā)展，研究人員已成功發(fā)現(xiàn)一些同時影響豬脂肪性狀和繁殖性狀的候選基因，如過氧化物酶體增殖物活化受體基因 (PPAR)[29-30]、瘦素受體基因 (LEPR)[31-32]和組蛋白去乙?；富?SIRT1)[33-34]等。

FTO在豬脂肪沉積過程中的mRNA表達結果表明，蘇山豬16種組織樣中均檢測到FTO的mRNA表達，且背膘中的表達量最高，并極顯著高于其他任何組織(P<0.01)，說明FTO作用廣泛，且主要在易脂肪沉積的組織中發(fā)揮作用；在背最長肌中的mRNA表達量，高脂豬顯著大于低脂豬(P<0.05)，說明FTO基因的高表達量與豬脂肪沉積量呈正相關，即FTO的高表達有利于脂肪沉積。在德國哥廷根小型豬中，研究者發(fā)現(xiàn)脂肪沉積時期，其肌肉、大腦、肝、腎和心臟中均表達FTO的mRNA，且組織間表達量差異顯著 (P<0.05)[12]。在蘇格蘭黑臉綿羊中，肥胖羊相較于普通羊，有更高的FTOmRNA表達量[35]。在蛋雞中，4～8周齡的快速生長期，垂體、下丘腦、肌肉、脂肪、睪丸等組織樣中均檢測到FTO的mRNA表達[36]。

FTO在豬胚胎附植過程中的mRNA表達結果表明，胚胎附植中期梅山豬15種組織樣中均檢測到FTO基因的mRNA表達，且繁殖組織中的表達量顯著高于其他組織(下丘腦除外)(P<0.05)，也顯著高于空懷豬。另外FTO在下丘腦中的表達量排名第三位，在垂體中也有表達，這說明FTO很可能通過下丘腦-垂體-性腺軸在豬胚胎附植調控中發(fā)揮著重要的作用。Bassols等發(fā)現(xiàn)，人的子宮組織中FTO的mRNA表達量顯著高于其他組織，且FTO在子宮中的高表達量與不斷增加的胎兒體質量和長度顯著相關[37]。在大鼠中，妊娠時期肥胖的母鼠生下的斷奶仔鼠，在下丘腦和肝臟中均檢測到更高的FTOmRNA表達量[38]。 在大鼠和人中，胎盤組織中FTO的表達說明其可能是子宮內環(huán)境和胎兒生長之間相互聯(lián)系的橋梁[20]。

FTO的cSNPs及引起的氨基酸突變分析結果表明，蘇山豬FTO編碼序列(15～1 532 bp)上共發(fā)現(xiàn)10個cSNPs突變，其中有8個直接引起了編碼氨基酸的變化，這些突變可能會進一步引發(fā)基因功能的變化[39]；另外2個cSNPs也可能通過連鎖不平衡與直接影響繁殖性狀的位點相作用，從而間接影響到氨基酸直至蛋白質的變化[40-41]。FTO第3外顯子中的4個cSNPs在蘇山豬群中均檢測到2種以上的基因型，說明其可在蘇山豬、金華豬[18]等某些特定豬群中作為影響豬肉質和繁殖性狀的候選基因。

綜上所述，豬FTO是一個動態(tài)表達的基因，作用廣泛，脂肪沉積時期主要在脂肪組織中表達，胚胎附植時期主要在子宮、胚胎等繁殖組織中表達，在這2個機體活動中都發(fā)揮著重要的作用。在蘇山豬群編碼序列中發(fā)現(xiàn)的8個直接引起編碼氨基酸變化的cSNPs會在分子標記選擇輔助育種中發(fā)揮重要作用。

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