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    半滑舌鰨繁育群體的遺傳組成及家系配組策略

    2018-07-06 03:26:04李超魯翠云曹頂臣鄭先虎程磊李慶華薛志勇孫效文
    水產(chǎn)學(xué)雜志 2018年3期
    關(guān)鍵詞:舌鰨微衛(wèi)星家系

    李超 ,魯翠云 ,曹頂臣 ,鄭先虎 ,程磊 ,李慶華 ,薛志勇 ,孫效文

    (1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150070;2.海陽市黃海水產(chǎn)有限公司,山東 海陽 265122)

    半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis分布于黃、渤海地區(qū)的底層大型經(jīng)濟(jì)魚類,具有個(gè)體大、生長快、肉味鮮美等特點(diǎn),深受消費(fèi)者喜愛,逐漸成為我國海水養(yǎng)殖的重要種類。半滑舌鰨雌、雄個(gè)體生長速度相差懸殊,同齡個(gè)體雌性較雄性生長快30%~100%[1],鑒定性別特異分子標(biāo)記[2-4],利用雌核發(fā)育[5,6]、多倍體[7-9]等技術(shù)開展全雌性半滑舌鰨苗種培育成為研究熱點(diǎn)。但是,半滑舌鰨雌性異型性染色體(ZW)[10]的形式使其單性育種過程較雄性異型性染色體(XY)魚類更為復(fù)雜,無法獲得成活的“超雌”魚(WW),導(dǎo)致半滑舌鰨全雌魚的培育進(jìn)展緩慢[11,12]。

    家系選育和群體選育是常用的魚類育種方法。陳松林等[13,14]通過家系間生長及抗病等性能的測試,獲得了生長速度快、抗病力強(qiáng)的家系。近幾年,魚類分子育種發(fā)展迅速,結(jié)合傳統(tǒng)育種方法開發(fā)出的基于親本遺傳背景的分子育種技術(shù)方案,在避免近親繁殖、優(yōu)化群體遺傳結(jié)構(gòu)、維持群體遺傳多樣性等方面效果顯著,已應(yīng)用于鏡鯉Cyprinus carpio var.specularis、大黃魚Larimichthys crocea等魚類的選育中[15-18]。黎中寶等[19]研究表明,半滑舌鰨的2個(gè)養(yǎng)殖群體的平均多態(tài)位點(diǎn)比例(37.85%)較2個(gè)野生群體(42.57%)降低了12.47%。面對日益萎縮的野生資源,在半滑舌鰨選育中注意保護(hù)群體基因庫的豐度對種質(zhì)的持續(xù)利用十分必要。近十年來,半滑舌鰨已完成共顯性標(biāo)記[20]、高密度圖譜及經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)QTL[21,22]等遺傳資源的儲(chǔ)備,具備了開展分子育種的基礎(chǔ)。本研究利用20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析半滑舌鰨親魚群體的遺傳組成,檢測雌雄親本間的遺傳距離分布,確定半滑舌鰨家系配組雌、雄遺傳距離的最佳“閾值”范圍,根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果制定半滑舌鰨的配組策略。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    半滑舌鰨親魚樣品采自海陽市黃海水產(chǎn)有限公司。選擇體表健康無損傷、體色純正無白化、性腺發(fā)育較好的3齡后備親魚共291尾,其中雌魚98尾,平均體質(zhì)量(2 060±350)g,全長(64.18±4.94)cm,體高(19.84±1.83)cm;雄魚 193尾,平均體質(zhì)量(500±140)g,全長(42.08±4.77)cm,體高(11.78±1.48)cm。剪取部分鰭條組織用于提取基因組DNA[23],同時(shí)采用只讀式電子芯片進(jìn)行個(gè)體標(biāo)識(shí)。

    經(jīng)過分析獲得上述后備親魚的遺傳結(jié)構(gòu),根據(jù)個(gè)體間的遺傳距離劃分繁殖譜系,以混合家系的生產(chǎn)方式獲得選育組,以公司常規(guī)生產(chǎn)的苗種作為對照,進(jìn)行室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖。經(jīng)10個(gè)月養(yǎng)殖,分別從群體選育組和對照組子代中隨機(jī)選取300尾個(gè)體,測量體質(zhì)量、體長等生長性狀。

    1.2 標(biāo)記的選擇

    依據(jù)半滑舌鰨高密度遺傳連鎖圖譜[21]均勻選擇并合成191個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,隨機(jī)選用6個(gè)樣本篩選標(biāo)記的擴(kuò)增條件及多態(tài)性,最終用于群體分析的20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分布于12個(gè)連鎖群,其引物序列見表1。

    1.3 PCR擴(kuò)增及檢測

    用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,Code No.DP304)從鰭條組織中提取基因組DNA,紫外分光光度計(jì)定量后稀釋成50ng/μL。建立15μL PCR反應(yīng)體系,含有終濃度10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTP、0.5μmol/L引物,以及1U Taq DNA聚合酶和100ng DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min;94℃變性 30s,58℃復(fù)性 30s,72℃延伸 30s,27 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,銀染顯帶。以DL1000(Takara Bio Inc.,Code No.3590A)作為分子量標(biāo)準(zhǔn),用軟件Gel-ProAnalyzer(Version 4.5)分析電泳條帶的片段長度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    使用軟件“魚類種質(zhì)資源遺傳分析裝置(ZL200710144749.3)”將基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為“0,1”格式,用軟件POPGENE(Version 1.32)計(jì)算各標(biāo)記等位基因頻率(allele frequency,P)、等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(expected heterozygosi-ty,He)。

    表1 20個(gè)半滑舌鰨多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的引物信息Tab.1 Information of twenty microsatellite markers for half-smooth tongue sole C.semilaevis

    用Bosteine等[24]的公式計(jì)算多態(tài)信息含量(polymorphisminformation content,PIC):

    式中,Pi、Pj分別為群體中第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率,n為某一基因座上等位基因數(shù)。

    使用軟件 PHYLIP(Version 3.695)的 GENDIST程序,計(jì)算雌、雄個(gè)體間的遺傳距離,使用軟件“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”(登記號(hào)2011SR09-1052)繪制雌、雄個(gè)體聚類圖并劃分繁殖系譜。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記篩選及擴(kuò)增情況

    隨機(jī)選取6個(gè)半滑舌鰨樣本確定191個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的最適退火溫度及多態(tài)性。結(jié)果共有180個(gè)標(biāo)記獲得清晰、穩(wěn)定的目的條帶,112個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性,多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的比例為62.20%。從中選擇20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(表2)檢測全部樣本的基因型,片段大小在100~365bp之間,每個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出4~10個(gè)等位基因,共檢測到135個(gè)等位基因,多態(tài)信息含量在0.355~0.817之間,其中16個(gè)為高度多態(tài)標(biāo)記(PIC≥0.5)[24],占 80%(圖1)。

    2.2 雌、雄群體遺傳結(jié)構(gòu)

    鑒于半滑舌鰨雌、雄親魚的生長性狀差異巨大,對雌、雄繁育群體的遺傳結(jié)構(gòu)分別統(tǒng)計(jì)(表2)。結(jié)果:20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在雌性群體的有效等位基因數(shù)(Ne)為 1.792~5.686,平均為 3.578;雄性群體為1.471~6.116,平均為3.508,雌性群體略大于雄性群體,但是,成對樣本T檢驗(yàn)結(jié)果顯示,兩者的差異不顯著(P=0.713>0.05)。雌性群體的觀測雜合度(Ho)為0.418~0.835,平均為 0.606;雄性群體為 0.28~0.798,平均為0.548,雌性群體的觀測雜合度極顯著大于雄性群體(P=0.003<0.01)。雌性群體的期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)較雄性群體高,但也沒有達(dá)到顯著水平(期望雜合度P=0.077;多態(tài)信息含量P=0.081)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:該半滑舌鰨雌性群體的多態(tài)性略大于雄性群體,親魚繁殖群體保持了高度的遺傳多樣性水平(PIC>0.5)[24],具備進(jìn)一步繁殖、篩選優(yōu)良品系的遺傳潛力。

    在 20 個(gè)標(biāo)記中,cse22(174bp)、cse42(198bp)、cse71(195bp)、cse112(184bp)、cse179(171bp)和hncyse124(300bp)6個(gè)標(biāo)記的單個(gè)等位基因在雌、雄群體的等位基因頻率均超過了0.5(詳細(xì)數(shù)據(jù)未列出),提示人們在選育過程中要注意對稀有等位基因的保護(hù),減少與性狀無關(guān)的少量等位基因的富集。

    2.3 雌雄個(gè)體間遺傳距離及繁殖策略

    依據(jù)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)計(jì)算表明,半滑舌鰨雌、雄親本個(gè)體間的遺傳距離在0.254~1.959之間,平均值為0.890,不同遺傳距離范圍的頻率呈正態(tài)分布,其中個(gè)體間遺傳距離在0.7~1.0之間的占51.82%(圖2),根據(jù)子代優(yōu)良性狀與親本間遺傳距離呈“n”形曲線的規(guī)律[25],設(shè)定親本間遺傳距離閾值在0.7~1.0范圍之內(nèi)最佳。

    圖1 部分半滑舌鰨親魚樣本在微衛(wèi)星標(biāo)記cse22、csou12和hncyse115的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR product of partial samples at cse22,csou12,and hncyse115 in half-smooth tongue sole C.semilaevis

    表2 半滑舌鰨群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity index of microsatellite loci in half-smooth tongue sole C.semilaevis population

    圖2 半滑舌鰨雌、雄個(gè)體間遺傳距離分布Fig.2 Profile of genetic distance between female and male in half-smooth tongue sole C.semilaevis population

    用“基于親本遺傳背景的分子育種軟件1.0”采用家系配組和群體配組相結(jié)合的方式劃分繁殖系譜,最終確定半滑舌鰨的繁殖策略為:選擇位于不同繁殖系譜、遺傳距離在0.7~1.0之間,且表型性狀在均值以上的一對或多對親本生產(chǎn)單家系或混合家系。

    根據(jù)此策略獲得的混合家系選育組,對體質(zhì)量、體長等生長性狀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,在相同養(yǎng)殖條件下,經(jīng)本策略獲得的混合家系選育組半滑舌鰨的平均體質(zhì)量、體長與對照組差異顯著,其中平均體質(zhì)量高于對照組24.56%,平均體長高于對照組6.98%(表3)。

    表3 半滑舌鰨親本經(jīng)選育的子代和對照組子代的生長性狀Tab.3 Growth of F1in selective population and control population in half-smooth tongue sole C.semilaevis

    3 討論

    自21世紀(jì)初半滑舌鰨的人工繁殖及工廠化育苗技術(shù)逐漸成功以來,由于價(jià)值高、利潤大,苗種繁育和成魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛。維持繁殖群體內(nèi)的遺傳多樣性水平是群體持續(xù)利用的前提和保障。本研究采集的半滑舌鰨繁殖群體樣本較大,雌性的有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量4項(xiàng)遺傳參數(shù)分別為 3.578、0.606、0.696和0.654;雄性分別為 3.508、0.548、0.655 和 0.616,表明半滑舌鰨育種群體處于高度的多態(tài)水平,具備進(jìn)一步開展品種選育和生產(chǎn)的潛力。但是,遺傳參數(shù)較 2011 年徐營等[26]的研究結(jié)果(3.935、0.7135、0.7303和0.6804)已有所降低。多項(xiàng)研究也表明,養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較野生群體有顯著降低[19,27]。因此,在野生資源日益萎縮,無法及時(shí)補(bǔ)充現(xiàn)有養(yǎng)殖群體的遺傳多度的情況下,在育苗過程中保護(hù)現(xiàn)有遺傳資源非常必要。

    在獲得經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí),多代近交帶來的性狀衰退也非常嚴(yán)重。以半滑舌鰨白化病為例,在母本均為養(yǎng)殖群體的情況下,父本為養(yǎng)殖群體的家系的平均白化率(19.38%)遠(yuǎn)高于父本為野生群體的(3.21%)[28]?;谟H本遺傳背景的分子育種技術(shù)能夠最大限度地避免近親交配[15],其中最核心的技術(shù)要點(diǎn)就是要首先確定最佳雌、雄親本間配組的遺傳距離“閾值”。本研究利用20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了半滑舌鰨雌、雄個(gè)體間的遺傳距離,發(fā)現(xiàn)其分布呈正態(tài)性,與家系生長性狀和親本間遺傳距離的相關(guān)性趨勢相似。魯翠云等[16]的研究發(fā)現(xiàn),隨著鏡鯉親本間遺傳距離的增加,家系的生長性狀呈先升高后下降的趨勢,配組的最佳遺傳距離范圍在0.5~0.7之間。畢金貞等[29]對牙鲆Paralichthys olivaceus的研究中得到了相似的結(jié)果,隨著遺傳距離的增大,遺傳距離與性狀的關(guān)系呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(D=0.2578~0.5958)、無顯著相關(guān)性(D=0.6099~0.6604)到顯著負(fù)相關(guān)(D=0.6640~0.9773)的變化。因此,結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和本研究結(jié)果,確定指導(dǎo)半滑舌鰨家系配組的親本間遺傳距離范圍為0.7~1.0之間。

    半滑舌鰨作為近十幾年新興的海水養(yǎng)殖魚類,親魚多為經(jīng)過人工馴化的野生種或選育時(shí)間短的累代養(yǎng)殖種,在選育過程中制定正確的選育方式,避免近親繁殖,保護(hù)群體遺傳多樣性對種質(zhì)資源的持續(xù)利用及養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展十分必要。本研究借鑒其他魚類的分子育種經(jīng)驗(yàn),結(jié)合研究結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)際,制定出半滑舌鰨分子育種的策略為:選擇位于不同繁殖系譜,遺傳距離在0.7~1.0之間,且表型性狀在均值以上的一對或多對親本生產(chǎn)單家系、混合家系或群體繁殖,將群體內(nèi)或家系內(nèi)的近交系數(shù)降至最低,以最大限度地避免由近親繁殖造成的優(yōu)良性狀衰退,并在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)、篩選性狀優(yōu)良的基礎(chǔ)群體。

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