PM2.5聯(lián)合中波紫外線處理對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響

牛夢(mèng)鴿 謝雄雄 王超鵬 周美娟

南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)系，廣東省熱帶病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510515）

隨著對(duì)環(huán)境污染關(guān)注，大氣顆粒物（particulate matter，PM）已經(jīng)成為環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。由于PM2.5粒徑小，表面積相對(duì)大，因而更容易富集環(huán)境中存在的金屬離子、細(xì)菌、病毒、有機(jī)物質(zhì)以及酸性氧化物等，并對(duì)人體健康造成不良影響［1］。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道暴露于PM2.5可以引起特異性皮炎、痤瘡、濕疹等炎癥性皮膚疾病以及促進(jìn)皮膚老化［2-4］，但具體發(fā)生機(jī)制還不明確。國(guó)內(nèi)外研究證明PM2.5可以通過(guò)氧化應(yīng)激產(chǎn)生炎癥因子［5-6］，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡或者自噬。日光中的紫外線，尤其是中波紫外線（UVB），是造成人體皮膚損害最常見(jiàn)的環(huán)境因素之一，角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚表皮的重要組成部分，占表皮細(xì)胞的90%，是UVB輻射的主要靶細(xì)胞。UVB作用角質(zhì)形成細(xì)胞，可通過(guò)氧化應(yīng)激，DNA損傷等引起其輻射損傷［7-9］，甚至誘發(fā)皮膚癌［10］。暴露于外界環(huán)境中的人體皮膚是極易受到上述兩種環(huán)境致傷因素的聯(lián)合作用，但目前二者聯(lián)合處理后對(duì)皮膚細(xì)胞的影響尚不清楚，本研究基于此，嘗試性探討了PM2.5聯(lián)合UVB處理對(duì)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，購(gòu)自武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），0.25%Trypsin-EDTA（美國(guó)Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMSO（廣東光華科技股份有限公司），Annexin V雙標(biāo)凋亡檢測(cè)試劑盒（北京全式金生物公司），紫外照射源（上海顧村光電儀器廠），超聲清洗器（DL-720A），冷凍真空干燥機(jī)（CHRIST 1-2LD plus），流式細(xì)胞儀器（FACS），電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（X SeriesⅡ）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，在5%CO2，37℃條件下，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 處理方法

1.3.1 PM2.5懸液制備及成分分析 PM2.5采樣濾膜來(lái)自2016年11月23日廣州地區(qū)采集72 h的樣品。將采樣濾膜剪成1 cm×4 cm大小，浸入50 mL超純水中，超聲處理1 h，用潔凈扁圓頭鑷子單向反復(fù)輕刮擦濾膜表面，至濾膜由黑色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\白色，制備成懸液，懸液經(jīng)6～8層紗布過(guò)濾后分裝于玻璃瓶中置于-80℃冰箱過(guò)夜。樣品置于真空冷凍干燥器進(jìn)行冷凍干燥處理，待其水分蒸發(fā)后可得干燥灰色絮狀物，稱重容器內(nèi)獲取的絮狀物重量，加入相應(yīng)體積的PBS配制成終濃度為5 mg/mL的PM2.5儲(chǔ)備液，高壓滅菌后-20℃保存，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基配制成相應(yīng)的濃度。

1.3.2 細(xì)胞分組與處理 將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（NC組）、單純IC50濃度的PM2.5處理組（PM2.5組）、單純30 mJ/cm2的UVB照射組（UVB組）和PM2.5聯(lián)合UVB處理組（聯(lián)合處理組）。將HaCaT細(xì)胞消化后制成105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，并按一定細(xì)胞數(shù)量分別接種于96孔板、6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后，各組分別用PBS清洗3次后進(jìn)行相應(yīng)處理。UVB組和聯(lián)合處理組置于距離UVB紫外光輻射源（光源波長(zhǎng)為305 nm，功率密度0.165 mW/cm2，輻照劑量=輻射密度×輻射時(shí)間）40 cm的紫外光源箱體指定位置，累計(jì)照射劑量達(dá)30 mJ/cm2，對(duì)照組和PM2.5組給予同等條件下假照射，即除不照射UVB外，其余處理過(guò)程均與UVB組和聯(lián)合處理組一致。照射完畢后對(duì)照組和UVB組分別加入完全培養(yǎng)基，PM2.5組和聯(lián)合處理組分別加入含PM2.5質(zhì)量濃度為300 μg/mL的完全培養(yǎng)基，所有組別細(xì)胞處理完畢后均置于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化離心收集后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔加入100 μL，將96孔板置于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的PM2.5懸液，終濃度為5、10、25、50、100、200、400 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。染毒24 h后棄上清，清洗3次后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀振蕩10 min，測(cè)量OD570nm處各孔的吸光值；細(xì)胞存活率=（檢測(cè)組OD-空白孔OD）/（對(duì)照組OD-空白孔OD）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞完成處理后收集細(xì)胞，加入50 μL預(yù)冷的1×Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入2.5 μL Annexin V-FITC 和2.5 μLPI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng) 15 min，加入200 μL預(yù)冷的1×Annexin V Binding Buffer，輕輕混勻，冰上避光放置，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接受各處理24 h后收集細(xì)胞提取蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（1∶5 000）后4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗三次后加入相應(yīng)的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，最后經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料經(jīng)檢驗(yàn)服從正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，多個(gè)樣本進(jìn)行比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett-T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5樣品金屬成分鑒定 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)樣品中金屬所占含量由多到少依次為：Ca、Zn、Ba、Al、Mg、Cu、Pb、Mn，其余測(cè)出的金屬含量均低于0.50 mg/L，故未列出（表1）。

表1 在PM2.5樣品中檢測(cè)金屬成分含量Tab.1 Detection of metal components in the sample PM2.5

2.2 不同濃度（0、5、10、25、50、100、200、400 μg/mL）的PM2.5處理HaCaT細(xì)胞的IC50的分析 在0～400 μg/mL范圍內(nèi)，PM2.5處理細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞活力的抑制呈劑量依賴性地上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。不同濃度的PM2.5對(duì)細(xì)胞活力的抑制趨勢(shì)變化符合對(duì)數(shù)方程y=6.905 5ln（）+10.351，R2=0.975，計(jì)算出PM2.5的IC50約為300 μg/mL。

圖1 不同濃度的PM2.5處理HaCaT細(xì)胞對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 The effect of PM2.5 treatment with different concentrations on the inhibition of cell viability in HaCaT

2.3 PM2.5處理HaCaT細(xì)胞后細(xì)胞活力隨時(shí)間的變化趨勢(shì) 在不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、9、12、15、18、24 h），PM2.5對(duì)細(xì)胞活力的抑制總體呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，其中，在處理后3 h，對(duì)細(xì)胞活力的抑制率可達(dá)30%，隨后對(duì)細(xì)胞活力的抑制呈緩慢上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

2.4 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及活力變化 各組在接受相應(yīng)處理后24 h，NC組的HaCaT細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞緊湊排列，邊界清晰，PM2.5組和UVB組細(xì)胞均呈現(xiàn)形態(tài)皺縮、細(xì)胞有變圓變亮的情況，聯(lián)合處理組表現(xiàn)更為明顯，出現(xiàn)細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞完全失去正常形態(tài)。見(jiàn)圖3。MTT結(jié)果顯示：與NC組比，PM2.5、UVB及聯(lián)合處理24 h后細(xì)胞活力被抑制，差異顯著（P＜0.001），兩兩比較結(jié)果分析，聯(lián)合處理組細(xì)胞活力最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），顯示PM2.5與UVB照射聯(lián)合處理對(duì)抑制細(xì)胞活力有協(xié)同作用。見(jiàn)圖4。

圖2 PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的抑制在不同時(shí)間點(diǎn)的變化Fig.2 The inhibitory changes of cell viability at different time points after the treatment with PM2.5 in HaCaT

圖4 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組作用HaCaT后細(xì)胞活力變化Fig.4 The changes of cell viability after the treatment of NC，PM2.5，UVB and the combined group in HaCaT

2.5 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組HaCaT細(xì)胞的凋亡變化 流式細(xì)胞術(shù)觀察不同因素處理情況下細(xì)胞凋亡率的變化：結(jié)果顯示各組之間有差異（P＜0.05），其順序依次為UVB組＞PM2.5+UVB組＞PM2.5組＞NC組。兩兩比較的結(jié)果顯示，與NC組相比，單獨(dú)UVB或PM2.5處理以及聯(lián)合處理，均能增加細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率（P＜0.01）。但聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率又介于單純的PM2.5處理組和單純UVB照射組之間（P＜0.05）。見(jiàn)圖5、表2。

圖5 流式檢測(cè)NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡變化Fig.5 Flow cytometry was used to detect the changes of apoptosis of HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group

表2 流式檢測(cè)NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡百分比Tab.2 Flow cytometry was used to detect the percentage of apoptosisof HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group（n=3）±s

表2 流式檢測(cè)NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡百分比Tab.2 Flow cytometry was used to detect the percentage of apoptosisof HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group（n=3）±s

注：與NC組比較，*P ＜0.01；與PM2.5比較，#P ＜0.05；與UVB比較，※P＜0.01

組別NC PM2.5 UVB PM2.5+UVB凋亡率（%）6.65±2.38 15.85±0.84*38.40±4.96*24.17±4.07*#※

2.6 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組HaCaT細(xì)胞凋亡蛋白及自噬蛋白變化 與NC組相比，凋亡標(biāo)志蛋白PARP剪切體在PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組均增加，UVB組高于PM2.5組，聯(lián)合處理后較UVB組降低。與NC組相比，LC3-Ⅱ表達(dá)在PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組均增加，聯(lián)合處理組最多，PM2.5組其次，UVB組最少。見(jiàn)圖6。

圖6 NC組、PM2.5組、UVB組、以及聯(lián)合處理組HaCaT細(xì)胞蛋白表達(dá)變化Fig.6 The changes of protein of HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group

3 討論

隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程加快，環(huán)境污染日益加劇，空氣污染成為我國(guó)各個(gè)地區(qū)擔(dān)心的首要問(wèn)題。在眾多空氣污染物中，PM2.5對(duì)人體健康的危害最嚴(yán)重。大量國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究已經(jīng)報(bào)道了PM2.5對(duì)人體健康的危害，但這些研究多集中在PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)造成的危害［11］。近年來(lái)人們開(kāi)始意識(shí)到PM2.5對(duì)皮膚系統(tǒng)的影響，但具體作用還不明確，關(guān)于PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞的研究更少。臭氧空洞的形成，對(duì)太陽(yáng)輻射的吸收減少，照射到地面的太陽(yáng)光紫外線增加，使得人們接受到更多紫外輻射。而在現(xiàn)實(shí)生活中，人體皮膚同時(shí)會(huì)受到PM2.5、UVB兩種因素的聯(lián)合損傷。有研究表明UVB誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等對(duì)細(xì)胞造成損傷；PM2.5作用于HaCaT細(xì)胞后，產(chǎn)生炎癥因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬［6，12］。但尚未有研究涉及二者的聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞凋亡、自噬的影響，因此本研究嘗試性分析了PM2.5、UVB以及聯(lián)合處理對(duì)HaCaT細(xì)胞在細(xì)胞活力、凋亡、自噬方面的影響。

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的PM2.5（0～400 μg/mL）處理細(xì)胞24 h細(xì)胞活力的變化，發(fā)現(xiàn)PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞抑制率隨著濃度的升高而增加（圖1），這說(shuō)明PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞具有明顯的毒性作用，且計(jì)算出IC50為300 μg/mL，觀察到該濃度下PM2.5對(duì)細(xì)胞活力的抑制隨著時(shí)間（0～24 h）的推延，抑制效果呈上升趨勢(shì)（圖2），表明處理時(shí)間越長(zhǎng)，PM2.5對(duì)細(xì)胞的毒性作用越強(qiáng)。這和熊書(shū)晗等［13］研究的PM2.5對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的抑制作用是一致的。與NC組比，PM2.5組、UVB組、聯(lián)合處理組細(xì)胞活力均被顯著抑制（P＜0.001）；聯(lián)合處理組細(xì)胞活力小于PM2.5組、UVB組（P＜0.001），這說(shuō)明PM2.5、UVB二者對(duì)細(xì)胞活力的抑制具有協(xié)同作用，兩者相加，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞更嚴(yán)重的損傷。

筆者以往的實(shí)驗(yàn)中，就已經(jīng)明確UVB能影響細(xì)胞的功能，如DNA損傷、細(xì)胞凋亡等，本次研究發(fā)現(xiàn)不同處理組之間，HaCaT細(xì)胞的凋亡率依次為UVB組＞聯(lián)合處理組＞PM2.5組＞NC組，結(jié)合本研究對(duì)PM2.5金屬成分的分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5中含有一定量的Ca，且達(dá)到了30.55 mg/L。有研究發(fā)現(xiàn)皮膚中的鈣離子與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)［14］，高劑量UVB照射角質(zhì)細(xì)胞在低鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在正常含鈣培養(yǎng)基中角質(zhì)細(xì)胞對(duì)UVB引起的凋亡有抗性，但細(xì)胞在高劑量UVB處理后失去增殖能力［15］。在本研究中，鈣離子也可能通過(guò)上述機(jī)制，影響了細(xì)胞活力，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

為了進(jìn)一步分析聯(lián)合作用是通過(guò)何種途徑發(fā)揮對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響的，筆者檢測(cè)了凋亡標(biāo)志蛋白PARP和自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示：除NC組外，PARP蛋白在UVB組最高，聯(lián)合處理組其次，最后是PM2.5組，這與前面流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出的細(xì)胞凋亡趨勢(shì)一致，進(jìn)一步說(shuō)明聯(lián)合處理組中細(xì)胞凋亡被抑制了，即凋亡不是細(xì)胞活力比單純致傷因素進(jìn)一步降低的原因；而自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的變化趨勢(shì)為聯(lián)合處理組＞PM2.5組＞UVB組＞NC組，聯(lián)合處理組中LC3-Ⅱ增加，這說(shuō)明聯(lián)合作用后PM2.5可能誘導(dǎo)較強(qiáng)的自噬增加了UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的損傷。但是，聯(lián)合處理終究是通過(guò)哪些信號(hào)通路發(fā)揮作用的，其上下游信號(hào)通路有哪些，目前還不明確，也是筆者今后進(jìn)一步研究的方向。

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