野生胡麻愈傷組織誘導(dǎo)及其對NaCl脅迫的生理響應(yīng)

劉 風，趙 瑋

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070）

胡麻（油用亞麻）屬于亞麻科（Lianceace）亞麻屬（Linum）［1］，主要分布在甘肅、內(nèi)蒙、寧夏、山西、河北等省區(qū)［2］。胡麻油富含α-亞麻酸及各種人體必需的不飽和脂肪酸，具有促進智力發(fā)育、強身健腦、降血脂、預(yù)防血栓等作用，是我國工業(yè)用干性植物油和產(chǎn)區(qū)群眾主要的食用油來源［3-4］。此外，胡麻籽中木酚素質(zhì)量分數(shù)很高，這種物質(zhì)被人體吸收后，可以抑制癌癥，特別是能降低乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的發(fā)病率。胡麻籽中還富含可溶性植物纖維素，具有降低膽固醇的作用，經(jīng)常食用胡麻籽，可以降低便秘、肥胖、心臟病等發(fā)病率［5］。

野生胡麻主要生長在海拔1 500～2 000 m的高寒山區(qū)，為多年生草本植物，果小粒小易落粒，具有抗旱、抗寒、耐瘠薄、分莖多、生育期短的特性，是良好的抗逆性種質(zhì)資源。野生胡麻種子休眠性強，用常規(guī)方法很難繁殖成功，進行種質(zhì)資源保存頗有難度，不便于育種和遺傳利用研究。近年來，有關(guān)野生胡麻組織培養(yǎng)技術(shù)研究的報道不多，前期的研究多集中在培養(yǎng)基激素配比、外植體取材對栽培胡麻愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)以及再生植株分化的影響等方面。趙瑋等［6］研究優(yōu)化的栽培胡麻組織培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA（0.5 mg/L）+6-BA（1.5 mg/L）， 最適宜的外植體為下胚軸；頡瑞霞等［7］發(fā)現(xiàn)KT+2，4-D激素組合對胡麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果優(yōu)于KT+NAA；孫上峰等［8］通過對胡麻花藥的各種預(yù)處理的研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型在同一處理內(nèi)有不同的出愈率，同一基因型在不同預(yù)處理條件下有不同的出愈率；姬妍茹等［9］對野生亞麻的莖段進行無性擴繁獲得成功，初步確定MS（附加6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.05 mg/L）為莖段分化的適宜培養(yǎng)基，1/2MS（附加一定量的激素）培養(yǎng)基為不定芽保存培養(yǎng)基。

了解植物的耐鹽機理，研究鹽脅迫條件下植物的生理生化變化，對發(fā)展鹽堿地農(nóng)業(yè)，緩解糧食壓力具有重要的實踐意義［10］。目前抗鹽生理在胡麻領(lǐng)域相關(guān)研究很少。趙瑋等［11］分析了不同濃度的NaCl脅迫下不同抗旱性胡麻品種苗期和成株期農(nóng)藝性狀以及SOD、POD、MDA質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果表明，抗旱性強的胡麻品種同樣具有更強的耐鹽特性。本研究通過篩選最佳野生胡麻愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼而將愈傷進行不同濃度NaCl脅迫，分析愈傷增殖率及其生理特性，從而篩選出優(yōu)質(zhì)野生胡麻資源，為抗逆胡麻優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試野生胡麻種質(zhì)資源共8個，分別為烏蘭察布藍花、烏蘭察布紅花、張家口藍花、定西藍花、蘭州藍花、平?jīng)鏊{花、臨洮藍花、會寧藍花，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所品種資源研究室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在MS培養(yǎng)基上分別添加NAA質(zhì)量體積分數(shù)為0、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L，6-BA質(zhì)量體積分數(shù)為0、0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mg/L， 編號為 LM1～LM25（表1）。NaCl脅迫愈傷組織培養(yǎng)基：用篩選出的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，分別添加NaCl溶液0（CK）、50、100、 150、 200、 250 mmol/L 各 50 mL 于250 mL三角瓶中進行懸浮培養(yǎng)。

1.2.2 材料處理與指標測定 愈傷誘導(dǎo)：將野生胡麻種子分別用70%的酒精表面殺菌30 s，再用0.1%的HgCl2消毒5～6 min，用無菌蒸餾水沖洗4次，然后接種于含有40 mL的MS培養(yǎng)基三角瓶中。每瓶20粒，待其萌發(fā)5 cm后剪切下胚軸1 cm作為外植體，分別接種于裝有不同激素配比濃度培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種5個外植體，每組10瓶，3次重復(fù)。觀察并記錄不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)影響。

NaCl脅迫愈傷組織：篩選出野生胡麻愈傷組織塊，分別接種于裝有不同NaCl脅迫濃度培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種5塊愈傷，每組10瓶，3次重復(fù)。記錄初始重量和愈傷組織狀態(tài)，培養(yǎng)40 d后觀察并記錄不同濃度NaCl脅迫對愈傷組織增殖的影響。

生理指標測定：通過不同濃度NaCl脅迫，篩選耐鹽型和敏感型野生資源愈傷組織，分別進行SOD、CAT、POD、MDA等生理指標測定，分析野生胡麻愈傷組織對NaCl脅迫的生理響應(yīng)。

1.2.3 培養(yǎng)條件 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)為黑暗培養(yǎng)、溫度（23±2）℃。待胚狀體長出、進入分化階段時進行光照培養(yǎng)，光照強度1 500～2 000 Lx，光照時間16 h/d，溫度（23±2）℃。愈傷鹽脅迫為液態(tài)懸浮培養(yǎng)［12］：于120 r/min的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，溫度27～28 ℃，全程暗培養(yǎng)7 d后用新鮮液體培養(yǎng)基更換瓶中2/3的培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)40 d［13］。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.3 測定指標及計算方法

愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果通過愈傷誘導(dǎo)率和愈傷組織增殖率體現(xiàn)，計算公式如下。

愈傷誘導(dǎo)率（%）=（產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；

愈傷組織增殖率（%）=［（培養(yǎng)后愈傷總重-培養(yǎng)前愈傷總重）/培養(yǎng)前愈傷］×100%；

相對鹽害率＝［（對照愈傷增殖率－處理愈傷增殖率）/對照愈傷增殖率］×100%。

SOD酶活力指數(shù)=（SOD抑制率/2）×（反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/測定樣本蛋白濃度）

CAT活力指數(shù)=［（對照OD值-測定OD值）×271］/60×取樣量/待測樣本蛋白濃度

POD活力指數(shù)=［（測定OD值-對照OD值）/（12×比色光徑）］×反應(yīng)液總體積/取樣量/反應(yīng)時間/勻漿蛋白濃度×1 000

MDA含量=（MDA濃度×提取液體積）/植物組織鮮重

2 結(jié)果與分析

2.1 野生胡麻愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

在MS培養(yǎng)基上添加不同激素配比的結(jié)果（表2）顯示，不同野生胡麻種質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)率差別較大。LM19號培養(yǎng)基MS＋NAA（0.15 mg/L）＋6-BA（1.5 mg/L）對所有供試野生種質(zhì)平均愈傷誘導(dǎo)率在所有處理中最高，達到39.77%。其中烏蘭察布藍花愈傷誘導(dǎo)率最高，為90.00%；烏蘭察布紅花愈傷誘導(dǎo)率最低，只有13.50%。不同野生胡麻在LM19號培養(yǎng)基上的愈傷誘導(dǎo)率從大到小依次為烏蘭察布藍花、張家口藍花、定西藍花、平?jīng)鏊{花、會寧藍花、蘭州藍花、臨洮藍花、烏蘭察布紅花。

2.2 NaCl脅迫對野生資源愈傷耐鹽性評價

不同NaCl濃度脅迫下野生胡麻品種資源愈傷相對傷鹽害率結(jié)果（表3）顯示，隨著脅迫濃度的增加，所有種質(zhì)的平均鹽害率均為增長趨勢，NaCl濃度為250 mmol/L時平均鹽害率為96.29%，其中烏蘭察布紅花、定西藍花、平?jīng)鏊{花、臨洮藍花等4份種質(zhì)鹽害率達到100%；烏蘭察布藍花的鹽害率為78.42%，在所有供試材料中最低。以NaCl濃度為200 mmol/L時的相對鹽害率結(jié)果作為野生胡麻資源耐鹽性評價標準，得出野生胡麻資源耐鹽性由大到依次為烏蘭察布藍花、定西藍花、會寧藍花、蘭州藍花、張家口藍花、平?jīng)鏊{花、臨洮藍花、烏蘭察布紅花。對愈傷組織長勢的觀察結(jié)果表明，耐鹽性強的野生胡麻資源愈傷組織長勢更強，愈傷組織致密、顏色深綠、成團性好，而敏感型資源普遍較疏松，顏色清淡、玻璃化嚴重。

表2 不同激素配比愈傷組織誘導(dǎo)率 /%

表3 不同NaCl濃度脅迫下相對鹽害率 /%

2.3 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷SOD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其活性的高低變化反映了植物對氧化損傷的修復(fù)能力［14］。將耐鹽型野生胡麻種質(zhì)烏蘭察布藍花和敏感型野生種質(zhì)烏蘭察布紅花愈傷組織進行生理指標測定。通過圖1可以看出，隨著NaCl濃度增加，烏蘭察布藍花和烏蘭察布紅花2種野生胡麻愈傷SOD質(zhì)量分數(shù)均呈相同變化趨勢，并且SOD活性均在NaCl濃度為250 mmol/L時達到峰值，其中敏感型野生胡麻烏蘭察布紅花最高值為對照的1.66倍，耐鹽型胡麻種質(zhì)烏蘭察布藍花最大值為對照的1.65倍。

圖1 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷SOD活性

2.4 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷CAT活性的影響

CAT和SOD都能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其活性的高低變化同樣反映了植物對氧化損傷的修復(fù)能力［15］。通過圖2可以看出，隨著NaCl脅迫濃度的增加，耐鹽型野生胡麻烏蘭察布藍花平均CAT質(zhì)量分數(shù)高于敏感型野生胡麻資源烏蘭察布紅花1.73倍。敏感型野生胡麻CAT質(zhì)量分數(shù)在NaCl濃度150 mmol/L脅迫下達到最高值，為對照的3.35倍；耐鹽型資源在NaCl濃度200 mmol/L脅迫下達到最高值，為對照的5.21倍。

圖2 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷CAT活性

2.5 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷POD活性的變化特征

POD是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，可清除植物體內(nèi)SOD催化反應(yīng)的產(chǎn)物過氧化氫，從而使需氧生物體免受過氧化氫的毒害［16］。從圖3可以看出，不同濃度NaCl脅迫后，敏感型野生胡麻烏蘭察布紅花POD質(zhì)量分數(shù)在NaCl濃度為50 mmol/L時達到最高，為對照的2.15倍；NaCl濃度為250 mmol/L時POD質(zhì)量分數(shù)與對照相當。耐鹽型種質(zhì)的POD含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢，且在NaCl濃度為250 mmol/L時POD含量達到最大值，為對照的1.79倍。

圖3 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷POD活性

2.6 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷MDA含量的變化影響

丙二醛（MDA）的質(zhì)量分數(shù)代表植物膜脂過氧化的水平，反映植物受傷害的程度［17］。通過圖4可以看出，不同濃度NaCl脅迫下兩類野生胡麻愈傷組織MDA質(zhì)量分數(shù)均出現(xiàn)增加的趨勢，當NaCl脅迫達到200 mmol/L時，兩類野生種質(zhì)的愈傷MDA質(zhì)量分數(shù)均達到最大值，其中敏感型MDA最大含量是對照的13.00倍，耐鹽型MDA最大含量為對照的2.50倍。

圖4 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷MDA活性

3 結(jié)論與討論

對野生胡麻培養(yǎng)基配方的優(yōu)化結(jié)果顯示，不同激素配比對野生胡麻愈傷的誘導(dǎo)有顯著差異，其中烏蘭察布藍花愈傷誘導(dǎo)率最高，烏蘭察布紅花愈傷誘導(dǎo)最低，其原因一是紅花野生胡麻種子萌發(fā)率低且作為愈傷誘導(dǎo)外植體材料的下胚軸生長較為細弱，愈傷組織普遍疏松，顏色清淡、玻璃化嚴重，從而影響愈傷誘導(dǎo)。二是目前大田栽培品種以藍花為主，趙瑋等［11］通過對栽培品種隴亞10號的組培誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)其愈傷誘導(dǎo)較為容易，且最高可達100%。因此，藍花野生種質(zhì)可能具有和栽培品種相似的高愈傷誘導(dǎo)結(jié)果。

不同濃度NaCl脅迫下各種野生資源愈傷相對鹽害率均為增長趨勢。在NaCl濃度為250 mmol/L時平均鹽害率為96.29%，其中有4份種質(zhì)鹽害率達到100%，所以此濃度下的結(jié)果已不具有評價各種資源耐鹽性意義，故選擇NaCl濃度為200 mmol/L時的相對鹽害率結(jié)果作為野生胡麻耐鹽性評價依據(jù)。從觀察結(jié)果來看，愈傷誘導(dǎo)率高的野生種質(zhì)長勢更強，愈傷更加致密、深綠，相對含水量比疏松、玻璃化的愈傷低，受到鹽害時具有更高的防御性，如烏蘭察布藍花愈傷誘導(dǎo)率和耐鹽性均為首位，而烏蘭察布紅花愈傷誘導(dǎo)率和耐鹽性均位列最后。

在鹽分脅迫條件下，膜系統(tǒng)的變化首先表現(xiàn)為鹽分對膜系統(tǒng)的破壞，也反映其對鹽分的忍耐程度，然后是植物對膜系統(tǒng)的修復(fù)。膜系統(tǒng)的修復(fù)與SOD、CAT和POD酶活性的升高是分不開的［18］。本研究顯示，當受到不同濃度NaCl脅迫下耐鹽型野生種質(zhì)較敏感型種質(zhì)愈傷組織含有較高的SOD和CAT質(zhì)量分數(shù)。敏感型野生胡麻的CAT含量在NaCl濃度為150 mmol/L時達到最高，之后迅速下降；而耐鹽型野生資源含量在NaCl濃度為200 mmol/L時達到最高，且下降幅度明顯平緩，表明其CAT對膜系統(tǒng)的修復(fù)能力和持續(xù)性更強。敏感型種質(zhì)POD質(zhì)量分數(shù)變化趨勢為先上升后降低，NaCl濃度為50 mmol/L時POD質(zhì)量分數(shù)達到最高值，表明敏感型野生胡麻的愈傷組織對于NaCl脅迫更為敏感，而隨著NaCl濃度的增加POD自生的保護性酶濃度越來越低，發(fā)揮的作用越來越小。耐鹽型野生資源POD質(zhì)量分數(shù)總體呈現(xiàn)一直上升的趨勢，在NaCl濃度為250 mmol/L時POD質(zhì)量分數(shù)達到最大值。說明POD保護性酶的作用穩(wěn)定發(fā)揮，提高了其對鹽害的耐受性。

MDA間接反映膜受損狀況，并兼有反饋植物受傷害程度的作用［19］。本研究中，NaCl脅迫下兩類野生胡麻愈傷組織MDA質(zhì)量分數(shù)均明顯增加，表明兩類野生胡麻種質(zhì)的愈傷組織均受到了一定的傷害，而且隨著濃度的增加受傷害更嚴重。雖然耐鹽型野生種質(zhì)在NaCl脅迫下MDA質(zhì)量分數(shù)平均值遠高于敏感型野生種質(zhì)，但是與無脅迫處理相比，MDA質(zhì)量分數(shù)變化幅度不大，最高值也只有對照的1.83倍；而敏感型野生種質(zhì)在NaCl脅迫下MDA質(zhì)量分數(shù)發(fā)生劇烈變化，最高時為無脅迫處理的15.90倍，表明其細胞膜受損更重。

綜上所述，不同野生胡麻種質(zhì)的愈傷增值率、耐鹽性差異性顯著。耐鹽性野生胡麻愈傷組織在NaCl脅迫下SOD、CAT和POD等酶活性較敏感型更高，MDA含量變化幅度較敏感型小，表明耐鹽性種質(zhì)在鹽脅迫下膜細胞受鹽害程度相對較小，保護酶修復(fù)能力強，保護作用能夠更持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮。

［1］趙 瑋，黨占海，李聞娟.強抗旱胡麻新品種隴亞11號組織培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化研究［J］. 中國沙漠， 2012， 32（5）：1355-1361.

［2］黨占海，趙蓉英，王 敏，等.國際視野下胡麻研究的可視化分析［J］. 中國麻業(yè)科學， 2010， 32（6）： 305-307.

［3］王利民，張建平，米 君，等.國外引進油用亞麻品種資源農(nóng)藝性狀分析［J］.中國油料作物學報，2011，33（4）： 356-361.

［4］杜彥斌，王立軍，張 金，等.胡麻新品種天亞11號選育報告［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技， 2018（2）： 24-26.

［5］趙 利，黨占海，李 毅，等.亞麻籽的保健功能和開發(fā)利用［J］. 中國油脂， 2006， 31（3）： 71-73.

［6］趙 瑋，黨占海，張建平，等.胡麻胚狀體誘導(dǎo)及植株再生的研究［J］. 北方園藝， 2010（21）： 174-176.

［7］頡瑞霞，張建平，黨占海，等.激素和低溫預(yù)處理對胡麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響［J］.分子植物育種，2009， 7（6）： 1180-1185.

［8］孫上峰，王樹彥.提高胡麻花藥培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)鍵技術(shù)研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：36-38.

［9］姬妍茹，田玉杰，苑志輝，等.用組織培養(yǎng)法繁殖野生亞麻的研究［J］. 中國麻業(yè)， 2001， 23（4）： 8-11.

［10］郭建榮，鄭聰聰，李艷迪，等.NaCl處理對真鹽生植物鹽地堿蓬根系特征及活力的影響［J］.植物生理學報， 2017，53（1）： 63-70.

［11］趙 瑋，黨占海，張建平，等.NaCl脅迫對不同抗旱強度胡麻品種農(nóng)藝性狀和生理指標的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技， 2016（11）： 1-6.

［12］高 晶，那 日，朝魯蒙，等.電暈電場將大豆Gy3基因?qū)牖ò粲鷤椉爸仓暝偕跩］.中國沙漠，2011， 31（5）： 1202-1207.

［13］崔 林，范銀燕.裸燕麥胚性愈傷組織培養(yǎng)及懸浮系的建立［J］. 生物工程學報， 1998，14（1）： 46-50.

［14］武 沖，尹燕雷，陶吉寒，等.鹽脅迫對低溫預(yù)處理石榴種子萌發(fā)及幼苗生理生化的影響［J］.西北植物學報， 2015， 35（1）： 161-167.

［15］李志萍，張文輝，崔豫川．NaCl和Na2CO3脅迫對栓皮櫟種子萌發(fā)及幼苗生長的影響［J］．生態(tài)學報，2015， 35（3）： 742-751．

［16］葛春暉，計巧靈，王雪華，等.亞麻耐鹽性愈傷組織的生理生化特性［J］．植物研究， 2008， 9（5）： 603-607.

［17］張兆英，于秀俊.植物抗鹽性評價生理指標的分析［J］．滄州師范?？茖W校學報， 2006， 22（4）： 50-55.

［18］BOSE J， RODRIGO-MORENO A， SHABALA S．ROS homeostasis in halophytes in the context of salinity stress tolerance［J］.Journal of Experimental Botany，2014， 65（5）： 1241-1257．

［19］張金林，李慧茹，郭姝媛，等.高等植物適應(yīng)鹽逆境研究進展［J］. 草業(yè)學報， 2015，24（12）： 220-230.