淡紫灰鏈霉菌S3-5田間防效初探及生防制劑助劑的篩選

耿 琦， 余 洋， 劉絨梅， 田圓圓， 李璽洋，梁鵬寬， 石海春， 柯永培， 孫 群

(1. 四川大學生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610064;2. 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，四川 成都 611130)

0 引 言

玉米（Zea maysL.）屬禾本科玉蜀黍?qū)伲且环N世界性重要作物。玉米灰斑病是一種由尾孢菌引起的玉米植株真菌病害，最早于20世紀20年代在美國伊利諾斯州和亞歷山大州被發(fā)現(xiàn)[1]，在國內(nèi)于20世紀90年代在東北首次發(fā)現(xiàn)[2]，目前該病已嚴重影響我國的玉米產(chǎn)量（最高減產(chǎn)100%）及青貯玉米的質(zhì)量[3]。研究表明，相對低的溫度（20～25 ℃）與高濕的天氣有利于該病的發(fā)生及傳播[4-5]，而我國西南地區(qū)氣候濕度較大。同時，西南地區(qū)常見玉米栽培品種正紅532優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，抗倒伏，但對玉米灰斑病表現(xiàn)為高感；正紅311果穗粗大、抗旱耐瘠、為山地骨干品種，也是四川省農(nóng)業(yè)廳連續(xù)3年主導品種，然而對玉米灰斑病表現(xiàn)為感病。因而開展玉米灰斑病的綜合防治具有重要意義。

目前，對玉米灰斑病的防治方法有種植抗病品種，或采取翻耕、套種、輪作、間作種植等物理措施及噴施化學藥劑[6]?？共∑贩N培育周期較長，且由于病原菌菌株的多樣性，抗病品種具有地域局限性。物理措施比較費時費力，而化學農(nóng)藥噴施效果雖好，但在環(huán)境中有殘留，不易降解，且病原菌易產(chǎn)生抗性。植物病害的生物防控研究日益興起，對于玉米的一些病害或其他作物的灰斑病的防控研究已取得一定進展，如利用芽孢桿菌防治玉米大斑病[7]、熒光假單胞菌防治玉米紋枯病[8]、哈茨木霉防治玉米莖腐病[9]以及利用芽孢桿菌防治黑麥草灰斑病等[10]。現(xiàn)已有用于玉米的微生物種衣劑（AcceleronB -300SAT），可促進植物吸收營養(yǎng)、提高作物產(chǎn)量[11]，但尚未發(fā)現(xiàn)防治玉米灰斑病的生防制劑上市。

前期研究發(fā)現(xiàn)淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）S3-5對玉米灰斑病病原菌玉蜀黍尾孢菌（Cercospora zeae-maydisTehon & Daniels）有抑制作用，抑菌圈直徑達15 mm[12]。孢子作為S3-5的繁殖體，與菌絲相比，更易獲得，抗逆性更強，故以孢子為S3-5的使用形式。本研究利用正紅532、正紅311兩個品種進行田間試驗，通過噴施S3-5孢子懸液，探究其在田間防治玉米灰斑病的效果。由于孢子貯存或施用到田間時會受到溫度的影響，存活率下降，且田間環(huán)境中的紫外線會對孢子具有一定的殺傷作用，影響其萌發(fā)[13-14]，所以本文通過對穩(wěn)定劑、紫外保護劑進行篩選，提高S3-5孢子的存活率，延長制劑的效用時間，以增強S3-5在田間防治玉米灰斑病的效果，為S3-5生防制劑規(guī)?；a(chǎn)及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）S3-5，為實驗室保藏菌株。

1.1.2 試劑

穩(wěn)定劑：蔗糖（天津博迪化工股份有限公司），甲基纖維素（成都化夏化學試劑有限公司，100 000 mPa·s），海藻糖（成都金裕生物科技有限公司），乳糖（成都市科龍化工試劑廠），PEG 200（成都化夏化學試劑有限公司）；均121 ℃，15 min高壓蒸汽滅菌。

紫外保護劑：高嶺土（上海五四化學試劑廠），蒙脫石（蒙脫石散，博福-益普生（天津）制藥有限公司），維生素C（山西太原藥業(yè)有限公司），異維C鈉（源葉生物，98%）；維生素C和異維C鈉0.22 μm水相濾膜過濾除菌，其余試劑121 ℃，15 min高壓蒸汽滅菌。

玉米種子：正紅532、正紅311，為四川農(nóng)大正紅生物技術有限責任公司提供。

農(nóng)藥：氟硅唑（興農(nóng)帥星，有效成分含量400 g/L，乳油，興農(nóng)藥業(yè)（中國）有限公司）。

燕麥片瓊脂培養(yǎng)基(ISP3)：燕麥20 g，MnCl2·4H2O 0.001 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 儀器

艾科浦超純水機（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SL-N電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；ESJ電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；UV-C紫外燈（Philips，TUV 8W G8 T5，made in Poland，253.7 nm）；Olympus BX53 顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 淡紫灰鏈霉菌S3-5孢子懸液的制備

將S3-5接種在ISP3培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水進行沖洗，得到S3-5孢子懸液。

1.2.2 田間試驗

2016年于四川省廣元市朝天區(qū)曾家鎮(zhèn)（自然發(fā)病區(qū)）進行田間試驗，以探究S3-5孢子懸液對玉米灰斑病的防效。以噴施廣譜殺菌且滲透性強的內(nèi)吸性殺菌劑氟硅唑為陽性對照，以噴施海藻糖溶液為陰性對照。具體時間安排為：4月初進行玉米的播種，4月20日左右進行玉米植株的移栽，6月25日（小喇叭口期與大喇叭口期之間）對陰性對照組和2組處理組進行處理，7月3日（接近開花期）對陰性對照組、噴施2次S3-5孢子懸液的處理組及陽性對照組進行處理，自然發(fā)病，9月10日左右（乳熟期）進行病情統(tǒng)計。噴施藥液時力度較輕，盡量避免其飄散到相鄰植株。具體各組情況如表1所示。

表1 田間試驗分組1）

參考相關文獻[5, 15-17]，統(tǒng)計病情時采用方法如下：

1）從田間各組隨機選取5株植株作為樣本，采集其穗上、穗中、穗下3片葉子進行拍照統(tǒng)計。使用Adobe Photoshop CS6 軟件對玉米葉片的病斑相對面積進行測量。參照表2，根據(jù)之前得到的葉片病斑面積占葉片總面積的比例來對每片葉片進行病情分級，并計算田間各組病情指數(shù)及防治率。

表2 玉米灰斑病病級嚴重度分級標準1)-2)

2）根據(jù)各組發(fā)病程度及病情指數(shù)確定其抗性水平，具體的劃分標準如表3所示。

表3 病情指數(shù)對應抗性水平衡量標準

3）根據(jù)每組植株上葉片病斑占比，進行組間差異顯著性的分析。

1.2.3 穩(wěn)定劑篩選

參照相關文獻[18-21]，選擇表4中各物質(zhì)作為穩(wěn)定劑。參考企業(yè)標準信息公共服務平臺上成都普特生物科技股份有限公司開展熱貯穩(wěn)定性試驗的方法。

將各穩(wěn)定劑溶液與S3-5孢子懸液進行混合，得到含不同穩(wěn)定劑的S3-5孢子懸液（105～106CFU/mL），各組穩(wěn)定劑終濃度如表4所示。每組3個平行，每個平行取5 mL含穩(wěn)定劑的S3-5孢子懸液至10 mL離心管中，37 ℃遮光靜置處理，分別在第7 d、14 d取樣進行稀釋涂布，28 ℃培養(yǎng)2 d進行計數(shù)，以第0 d結果作為空白組，計算各時間點下各組S3-5孢子的存活率。同時以不含穩(wěn)定劑的S3-5孢子懸液作為對照，觀察各穩(wěn)定劑對S3-5孢子的保護作用，篩選出最佳保護劑。

表4 穩(wěn)定劑種類及含量

1.2.4 紫外保護劑篩選

參照相關文獻[22-24]，選擇表5中各物質(zhì)作為紫外保護劑，參考文獻方法[22-23]進行紫外保護劑篩選，在長136.5 cm的操作臺上進行試驗。操作臺左右兩端上空各裝備一支紫外燈用于照射（兩燈均距水平臺面41.5 cm，距操作臺內(nèi)側(cè)壁2.5 cm，至操作臺中央等距）。分別取含各種紫外保護劑的S3-5孢子懸液（105～106CFU/mL）8 mL于9 cm培養(yǎng)皿蓋上，放置培養(yǎng)皿蓋于操作臺中央，每組3個平行。靜置紫外照射10 min，每隔5 min取樣一次。將各組樣品進行稀釋涂布，28 ℃培養(yǎng)2 d后進行菌落計數(shù)。以不經(jīng)紫外照射的S3-5孢子懸液作為空白組，計算存活率。此外，以不含紫外保護劑的S3-5孢子懸液作為對照，以觀察各紫外保護劑對S3-5的紫外保護作用，篩選出最佳保護劑。

表5 紫外保護劑種類及含量

2 結果

2.1 田間試驗

如表6所示，噴施S3-5孢子懸液對正紅311上玉米灰斑病具有一定的防效，可將病情指數(shù)從高感水平降低到感病水平，其中：噴施1次可將灰斑病的病斑占比由72.24%降至62.93%，將病情指數(shù)由86.67%降至77.33%；而噴施2次可將灰斑病的病斑占比降至51.10%，將病情指數(shù)降至70.67%，且噴施兩次效果顯著（P<0.05）。但噴施S3-5孢子懸液對正紅532上玉米灰斑病的病斑占比及病情指數(shù)無影響。

表6 各組病斑占比及病情指數(shù)1）%

如表7所示，噴S3-5孢子懸液對正紅311上的玉米灰斑病有一定防效，其中噴施1次及2次的防治率分別為10.78%、18.46%。表明菌株S3-5在田間對玉米灰斑病具有防治作用，可優(yōu)化出相應助劑。噴施S3-5孢子懸液在正紅532上未見效果，這可能是因為正紅532為高感品種，其發(fā)病情況過于嚴重，所有處理包括陽性藥物均未見效。

表7 田間試驗處理組及陽性對照組防治率

2.2 穩(wěn)定劑篩選

如圖1所示，隨著處理時間的推移，各組S3-5孢子的存活率均有所下降。在第14 d，PEG 200組和甲基纖維素組的存活率較高，其中甲基纖維素組的存活率達到95.82%，PEG 200組的存活率達到46.04%，而乳糖、蔗糖、海藻糖組S3-5孢子存活率均非常低。甲基纖維素組在第7 d及第14 d孢子存活率與對照組差異顯著（P<0.05）。綜上，最佳穩(wěn)定劑為2.5%甲基纖維素。

圖1 不同穩(wěn)定劑對S3-5的保護

2.3 紫外保護劑篩選

如圖2所示，隨著紫外處理時間的增加，各組S3-5孢子的存活率均有不同程度的下降。在紫外處理10 min后，高嶺土、蒙脫石組存活率低于10%，而異維C鈉和維生素C存活率較高，均高于70%；且在紫外處理第5 min和第10 min，異維C鈉和維生素C組S3-5的存活率均與對照組在這兩個時間點的存活率差異顯著（P<0.05）?？紤]到保護效果及成本問題，故最佳紫外保護劑為0.3%異維C鈉。

圖2 不同紫外保護劑對S3-5的保護

3 結束語

現(xiàn)在對于植物病害的防治一般采用化學農(nóng)藥，同時已有蘇云金桿菌、芽孢桿菌、哈茨木霉等相關微生物農(nóng)藥上市售賣。從短期來看，微生物農(nóng)藥與化學農(nóng)藥相比，雖然防效不及化學農(nóng)藥，且施用時受到的影響因素較多，但可作為一種補充的方法。本研究中田間試驗表明噴施淡紫灰鏈霉菌S3-5孢子懸液對正紅311上玉米灰斑病具有一定的減輕效果，且噴施兩次效果顯著（P<0.05）。說明S3-5施用于田間對玉米灰斑病是有一定作用的，后續(xù)研究我們可以考慮將S3-5制劑與相容性較好的化學農(nóng)藥混用，這樣可以從一定程度上減少化學農(nóng)藥的使用，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的污染更小，使病原菌產(chǎn)生抗藥性幾率更低。

生防菌在田間的存活情況影響生防制劑在田間的防效。本文中生防菌淡紫灰鏈霉菌S3-5分離于玉米田中，故適應于玉米周圍的環(huán)境。將生防菌噴灑于田間，其生存將會受到諸如干燥、紫外、降水等因素的影響[23]，而在運輸過程中生防制劑也會受到溫度等的影響。本文中篩選出了0.3%異維C鈉作為紫外保護劑，2.5%甲基纖維素作為穩(wěn)定劑，在菌株抗紫外、抗高溫、貯存方面進行了探究。后續(xù)還需通過正交試驗等方法來確定穩(wěn)定劑和紫外保護劑的最佳濃度，并探究如何在田間惡劣環(huán)境下提供營養(yǎng)從而加快S3-5孢子萌發(fā)、提高存活等問題，從而提高S3-5生防制劑的效用。

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