氣相色譜法測定水產(chǎn)品中4種三唑類農(nóng)藥殘留

余 穎

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361013)

三唑類農(nóng)藥是一類含有1，2，4-三唑環(huán)的有機(jī)含氮雜環(huán)化合物，是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種殺菌劑，主要產(chǎn)品有三唑醇、烯唑醇、己唑醇、三唑酮、丙環(huán)唑和氟硅唑等30多個(gè)品種。這類農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)式上相同的部分是主鏈上含有羥基(酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基團(tuán)化合物。三唑類農(nóng)藥具有內(nèi)吸殺菌活性、廣譜、高效和低毒等特點(diǎn)，有的還具有植物生長調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，它的一些特殊理化性質(zhì)也使其具有長期有效和活性高的特性[1-3]。農(nóng)藥通過地表徑流、淋溶、沉降等方式進(jìn)入漁業(yè)環(huán)境，對(duì)漁業(yè)環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖造成間接或直接的危害。人類食用被農(nóng)藥污染的水產(chǎn)品，就有可能致畸、致癌、誘變，以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響和引起免疫系統(tǒng)的過敏反應(yīng)等[4]。

國內(nèi)外常用的三唑類農(nóng)藥檢測方法主要有以下幾類：1)液相色譜法，主要有分散液相微萃取-高效液相色譜法[5-6]、分子印跡固相萃取-高效液相色譜法[7-9]等；2)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，如超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]、分子印跡固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法[13]、QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]等；3)氣相色譜法[15-17]；4)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，如中空纖維膜液相微萃取-GC-MS法[18]、凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]、分散液-液微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[20-21]、氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源質(zhì)譜法[22]等。三唑類農(nóng)藥殘留檢測方法研究已在水質(zhì)、果蔬等基質(zhì)中廣泛開展，但在動(dòng)物源基質(zhì)中的研究鮮有報(bào)道，水產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥多組分殘留的檢測方法研究尚處空白。本研究采用微電子捕獲檢測器的氣相色譜法進(jìn)行檢測，建立了水產(chǎn)品中4種三唑類農(nóng)藥殘留量的檢測方法。微電子捕獲檢測器的氣相色譜法具有較高的靈敏度，不僅能夠滿足水產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥痕量殘留檢測的需求，也為三唑類農(nóng)藥相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定及其日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀(美國Agilent公司，6890N，帶63Ni微電子捕獲檢測器)；離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，LD4-8)；氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司，HGC-24)；旋渦振蕩器(德國IKA公司，MS3)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司，R205)；固相萃取裝置(美國Alltech公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250DE)。

乙腈、丙酮、正己烷為色譜純；無水硫酸鈉(650℃灼燒4 h，冷卻后貯于干燥器中備用)為分析純；石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱(CNW，1 000 mg/250 mg/6 mL)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)三唑酮、三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，分別用丙酮配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中，使用時(shí)再用丙酮配制成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 試樣制備

取待測水產(chǎn)品的可食部分，并充分均質(zhì)、混勻；將試樣于-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，旋渦振蕩30 s，超聲提取10 min。3 500 r/min離心5 min，移取上清液過無水硫酸鈉后收集于100 mL雞心瓶中。再往樣品中加入10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液于100 mL雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用1 mL正己烷溶解雞心瓶中的殘留物，待凈化。

1.2.3 凈化

石墨化碳黑-弗羅里硅土柱用5 mL正己烷，5 mL丙酮-正己烷(1∶9，V/V)溶液活化，樣液過柱并收集，用12 mL丙酮-正己烷(1∶9，V/V)溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液于40℃氮吹至近干，用正己烷定容至1 mL，供氣相色譜分析。

1.3 分析條件

色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度150℃，保持1 min，以15℃/min升到280℃保持5 min，再以20℃/min升到300℃保持3 min；進(jìn)樣口溫度：280℃，進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 μL；檢測器溫度：300℃；載氣：高純氮?dú)?純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜分析條件優(yōu)化

已報(bào)道的三唑類農(nóng)藥的氣相色譜分析方法中，色譜柱通常采用弱極性的DB-1MS[17]或DB-5MS[18]和中等極性的DB-17MS[22]。本研究比較了DB-5MS和DB-17MS這兩種色譜柱對(duì)4種三唑類農(nóng)藥的響應(yīng)值及分離效果。結(jié)果表明，2種色譜柱都能將4種目標(biāo)物完全分離，但采用DB-5MS色譜柱可獲得響應(yīng)值更高的目標(biāo)峰且峰型尖銳對(duì)稱，對(duì)目標(biāo)物的定性與定量更加準(zhǔn)確。進(jìn)樣口溫度是對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)值有較大影響的條件之一，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上確定進(jìn)樣口溫度為280℃，可在不引起樣品分解的情況下，使樣品全部組分完全汽化，以獲得最佳響應(yīng)值。按1.3已優(yōu)化的分析條件，4種三唑類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(三唑酮濃度為2.5 ng/mL，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇濃度為50.0 ng/mL)的色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理方法的研究

2.2.1 提取溶劑的選擇

水產(chǎn)品中含有較多的蛋白質(zhì)、油脂和色素等物質(zhì)，基質(zhì)比較復(fù)雜，為了降低后續(xù)樣品凈化的難度，應(yīng)選擇對(duì)目標(biāo)物溶解性好且對(duì)雜質(zhì)溶出盡可能小的溶劑。已報(bào)道的研究常采用乙酸乙酯、乙腈、正己烷、石油醚或丙酮等作為提取溶劑。本研究比較了乙酸乙酯、乙腈和正己烷對(duì)4種三唑類農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果見圖2。乙酸乙酯對(duì)4種目標(biāo)物的提取率無法都達(dá)到滿意的效果，且雜質(zhì)峰較多，基線噪音大，對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量造成干擾。乙腈的提取效果優(yōu)于正己烷，且正己烷對(duì)油脂及色素的溶解度也較大，會(huì)增加后續(xù)凈化的難度。因此選擇乙腈為提取溶劑，可獲得較滿意的提取效果。

2.2.2 凈化方法

由于水產(chǎn)品基質(zhì)的復(fù)雜性會(huì)干擾三唑類農(nóng)藥的定性定量分析，并對(duì)色譜柱及檢測器造成污染，且乙腈會(huì)使蛋白質(zhì)變性造成提取液渾濁，因此有必要對(duì)乙腈提取液進(jìn)行有效凈化。固相萃取是已報(bào)道的較常用的三唑類農(nóng)藥提取液的凈化方式。固相萃取不僅能對(duì)復(fù)雜樣品基質(zhì)進(jìn)行有效凈化，還可富集樣品中的極低濃度組分，并減少色譜應(yīng)用中的基質(zhì)效應(yīng)，在水產(chǎn)品痕量殘留的檢測中得到廣泛應(yīng)用。由于弗羅里硅土柱是三唑類農(nóng)藥殘留檢測中較常用的固相萃取柱，其對(duì)目標(biāo)物各組分的回收率高，且能有效去除雜質(zhì)，使雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰完全分離，而且部分含有色素的水產(chǎn)品如甲殼類、某些貝類等，石墨化碳黑能較好地吸附色素，使凈化效果更理想，因此本研究采用石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱對(duì)乙腈提取液進(jìn)行凈化，進(jìn)一步去除雜質(zhì)，能滿足檢測分析要求。

1)洗脫液的選擇

本研究比較了不同體積比的丙酮-正己烷溶液對(duì)4種三唑類農(nóng)藥的洗脫效果。分別比較了體積比為1∶9、3∶7、5∶5這3種溶液，結(jié)果見圖3，丙酮-正己烷溶液體積比為1∶9時(shí)，固相萃取柱上的待測組分基本能洗脫下來，回收率高于另兩種體積比的溶液，能滿足檢測要求。

注：1為丙酮-正己烷(1∶9，V/V)；2為丙酮-正己烷(3∶7，V/V)；3為丙酮-正己烷(5∶5，V/V)。

Notes：1 indicated acetone-n-hexane(1∶9，V/V)；2 indicated acetone-n-hexane(3∶7，V/V)；3 indicated acetone-n-hexane(5∶5，V/V).

2)洗脫體積的優(yōu)化

確定洗脫液之后，對(duì)洗脫液體積進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)物能從固相萃取柱上完全洗脫下來。將5 g空白樣品按1.2.2法提取，提取液加入4種三唑類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(三唑酮濃度為25 ng/mL，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇濃度為500 ng/mL)，濃縮液過石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱，用丙酮-正己烷(1∶9，V/V)溶液洗脫，收集不同體積的洗脫液，測定各目標(biāo)物的回收率。結(jié)果見圖4，在洗脫體積為12 mL時(shí)，目標(biāo)物各組分可完全被洗脫。

按優(yōu)化后的樣品前處理方法所得的日本對(duì)蝦空白樣品和加標(biāo)樣品(添加濃度分別為三唑酮0.4 μg/kg，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇8.0 μg/kg)色譜圖見圖5～圖6。結(jié)果表明，該方法前處理過程步驟少易操作，有機(jī)試劑用量少，樣品凈化效果較理想，適用于大量樣品的快速檢測。

2.3 方法有效性的評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍、檢出限和最低定量限

將4種三唑類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用丙酮配制成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，濃度分別為三唑酮1.25、2.50、25.00、62.50、125.00 ng/mL，三唑醇、環(huán)丙唑醇和聯(lián)苯三唑醇25、50、500、1 250、2 500 ng/mL，進(jìn)行氣相色譜分析，外標(biāo)法定量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。方法檢出限是以信噪比≥3估算，三唑醇、環(huán)丙唑醇和聯(lián)苯三唑醇檢出限均為4.0 μg/kg，三唑酮的檢出限為0.2 μg/kg。最低定量限的確定依據(jù)實(shí)際樣品加標(biāo)回收率在70%～120%之間，信噪比≥10，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度值。實(shí)驗(yàn)中4種三唑類各組分加標(biāo)濃度分別為三唑酮0.4 μg/kg，三唑醇、環(huán)丙唑醇和聯(lián)苯三唑醇8 μg/kg時(shí)，平均回收率為83.6%～86.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.77%～10.7%，且信噪比大于10。因此，本方法確定三唑酮的最低定量限為0.4 μg/kg，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇的最低定量限均為8.0 μg/kg。各組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和最低定量限見表1，三唑酮在1.25～ 125.00 ng/mL，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇在25～2 500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 7～0.999 8。

表1 4種三唑類農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和最低定量限

2.3.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按1.2所述方法，分別在鰻鱺、日本對(duì)蝦、鮑魚及龍須菜空白樣品中添加不同濃度的三唑類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加濃度分別為三唑酮0.4 μg /kg、4.0 μg/kg、8.0 μg /kg，三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇8 μg/kg、80 μg/kg、160 μg/kg，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次。為了驗(yàn)證方法的再現(xiàn)性，又進(jìn)行了這三個(gè)濃度水平的日間加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果分別見表2～表3，日內(nèi)平均回收率為78.8%～94.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.48%～11.4%；日間平均回收率為79.1%～95.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.92%～9.12%，均符合藥殘檢測技術(shù)要求。

表2 加標(biāo)樣日內(nèi)平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表3 加標(biāo)樣日間平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究建立了水產(chǎn)品中4種三唑類農(nóng)藥三唑酮、三唑醇、聯(lián)苯三唑醇和環(huán)丙唑醇?xì)埩舻臍庀嗌V檢測方法。樣品選用乙腈作為提取液，石墨化碳黑-弗羅里硅土復(fù)合柱進(jìn)行固相萃取，使樣品中蛋白質(zhì)、油脂和色素等雜質(zhì)得到有效凈化，前處理過程步驟少，縮短了樣品檢測周期，試劑用量少，檢測成本低，適合批量樣品的快速檢測。本研究對(duì)色譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高儀器對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)，建立的分析方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合藥殘檢測技術(shù)要求，可應(yīng)用于水產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥殘留的日常檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡智華，郭正元.三唑類殺菌劑的研究進(jìn)展[J].農(nóng)化新世紀(jì)，2006，(3)：17-18.

[2]王佳韻，張一賓.全球三唑類殺菌劑的市場概況及發(fā)展趨勢[J].農(nóng)藥，2017，(2)：30-31.

[3]周子燕，李昌春，高同春，等.三唑類殺菌劑的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(27)：11842-11844.

[4]張會(huì)芳.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜水果中18種三唑類殺菌劑殘留的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2012.

[5]胡楠，伍心妮，王和平，等.分散液相微萃取-高效液相色譜法測定三唑類衍生物[EB/OL].[2012-07-01][2018-06-05]/.http://www. cnki. net/KCMS/detail/detail.aspx? QueryID=1&CurRec=2&filename=HNHX20120700139&dbname=CPFD09 14&dbcode=CPFD&pr=&urlid=&yx=&v=MzE2NjRadTV2RUNuaFU3dk5KMTRVTFRVTFNQ RGRyRzRIOVBNcUk5Rlp1Z0dDQk5LdWhkaG5qOTh UbmpxcXhkRWVNT1VLcmim.

[6]張敏，黃其亮，殷帥，等.基于離子液體的分散液相微萃取-高效液相色譜法測定水中三唑類農(nóng)藥[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，21(3)：341-345.

[7]胡靜，吳曉燕，高文惠.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法分析2種三唑類殺菌劑殘留[J].藥物分析雜志，2012，(6)：1043-1047.

[8]趙春娟，龐軍，高文惠.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法分析食品中3種三唑類殺菌劑殘留[J].中國食品學(xué)報(bào)，2015，15(3)：175-180.

[9]高文惠，王姣姣.分子印跡固相萃取膜-高效液相色譜法檢測糧谷中的三唑類殺菌劑[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30(12)：225-229.

[10]王菲，李彤，馬辰.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中三唑類殺菌劑及三嗪類除草劑的殘留量[J].色譜，2013，31(3)：191-199.

[11]Beste K Y，Burkhardt O，Kaever V.Rapid HPLC-MS/MS method for simultaneous quantitation of four routinely administered triazole antifungals in human plasma [J].Clinica Chimica Acta，2012，413(1-2)：240-245.

[12]Raina R，Smith E.Determination of azole fungicides in atmospheric samples collected in the canadian prairies by LC/MS/MS [J].Journal of Aoac International，2012，95(5)：1350-1356.

[13]胡艷云，徐慧群，姚劍，等.分子印跡固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測定果蔬中20種三唑類農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué)，2014，42(2)：227-232.

[14]孫星，丁悅，汪佳蕾，等.QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中多效唑殘留[J].食品科學(xué)，2014，35(8)：76-79.

[15]劉紅梅，李文英，黎小鵬，等.全自動(dòng)索氏提取-氣相色譜法檢測小麥粉中菊酯、取代苯類、三唑類農(nóng)藥殘留[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39(12)：93-95.

[16]吳俐，陳銘學(xué)，牟仁祥，等.植物源食品中6種三唑類殺菌劑殘留量的氣相色譜法測定[J].分析測試學(xué)報(bào)，2009，28(7)：846-848，854.

[17]徐穎潔.SPE-GC-μECD測定蔬菜中6種三唑類農(nóng)藥的殘留量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(18)：5813-5815.

[18]陳麗華，張麗君，張磊，等.中空纖維膜液相微萃取-GC-MS測定水果和蔬菜中三唑類殺菌劑殘留量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(1)：413-418.

[19]李繼革，王玉飛，施家威，等.分散液-液微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定水中13種三唑類殺菌劑[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，(6)：1345-1349.

[20]賈楠.凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定農(nóng)產(chǎn)品中18種三唑類殺菌劑殘留的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2013.

[21]Farajzadeh M A，Djozan D，Mogaddam M R，et al.Extraction and preconcentration technique for triazole pesticides from cow milk using dispersive liquid-liquid microextraction followed by GC-FID and GC-MS determinations[J].Journal of separation science，2011，34(11)：1309-1316.

[22]沈偉健，桂茜雯，余可垚，等.氣相色譜-負(fù)化學(xué)離子源質(zhì)譜測定大豆和玉米中12 種三唑類殺菌劑的殘留量[J].色譜，2009，27(1)：91-95.